Agencia Estatal Boletín Oficial del Estado

POR ORDENES DE 31 DE ENERO DE 1977 (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DE LOS DIAS 17 A 27 DE JULIO); 31 DE JULIO DE 1979 (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DE LOS DIAS 29 A 30 DE AGOSTO); 17 DE SEPTIEMBRE DE 1981 (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DE 14 DE OCTUBRE); 1 DE DICIEMBRE DE 1981 (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DE 20 DE ENERO DE 1982), Y 9 DE OCTUBRE DE 1985 (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DE 15 DE NOVIEMBRE), SE ESTABLECIERON DIVERSOS METODOS OFICIALES DE ANALISIS DE ACEITES Y GRASAS.

LA SITUACION MOTIVADA POR NUESTRA ENTRADA EN LA COMUNIDAD ECONOMICA EUROPEA HACE NECESARIO ARMONIZAR NUESTRA LEGISLACION CON LA CORRESPONDIENTE COMUNITARIA, ESPECIALMENTE CON LO DISPUESTO EN LA DIRECTIVA DE LA COMISION 80/891/CEE, DE 25 DE JULIO (<DIARIO OFICIAL DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS> NUMERO L 254, DE 27 DE SEPTIEMBRE), RELATIVA AL METODO DE ANALISIS COMUNITARIO PARA LA DETERMINACION DEL CONTENIDO EN ACIDO ERUCICO EN LOS ACEITES Y GRASAS DESTINADOS COMO TALES A LA ALIMENTACION HUMANA, Y EN LOS PRODUCTOS ALIMENTICIOS QUE CONTENGAN ACEITES O GRASAS AÑADIDOS. ESTA UNIFORMIDAD DE CRITERIOS BASTARIA POR SI SOLA PARA CONFERIR EL CARACTER DE BASICA A LA PRESENTE NORMA.

AL MISMO TIEMPO LA PRESENTE ORDEN PRETENDE DAR CUMPLIMIENTO A LAS EXIGENCIAS REQUERIDAS POR EL TRIBUNAL CONSTITUCIONAL EN EL SENTIDO DE QUE NORMAS Y QUE PRECEPTOS CONCRETOS DE LAS MISMAS REUNEN AQUELLAS CARACTERISTICAS QUE LAS CONFIERAN EL CARACTER DE NORMAS BASICAS.

EN ESTE SENTIDO, <LA DETERMINACION, CON CARACTER GENERAL, DE LOS REQUISITOS SANITARIOS DE LAS REGLAMENTACIONES TECNICO-SANITARIAS DE LOS ALIMENTOS, SERVICIOS O PRODUCTOS, DIRECTA O INDIRECTAMENTE RELACIONADOS CON EL USO Y CONSUMO HUMANOS> CORRESPONDE A LA ADMINISTRACION DEL ESTADO, EN VIRTUD DE LO DISPUESTO EN EL ARTICULO 40.2 DE LA LEY 14/1986, DE 25 DE ABRIL, GENERAL DE SANIDAD (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DEL 29).

POR SU PARTE, EL ARTICULO 4.1.G) DE LA LEY 26/1984, DE 19 DE JULIO, GENERAL PARA LA DEFENSA DE LOS CONSUMIDORES Y USUARIOS (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DEL 24), ESTABLECE COMO PARTE INTEGRANTE DE AQUELLAS REGLAMENTACIONES TECNICO-SANITARIAS, ENTRE OTROS EXTREMOS, <LOS METODOS OFICIALES DE ANALISIS, TOMA DE MUESTRAS, CONTROL DE CALIDAD E INSPECCION>, DE LOS PRODUCTOS CITADOS. Y EL ARTICULO 39.1 DE LA MISMA LEY ESTABLECE, ENTRE OTRAS COSAS, QUE <CORRESPONDERA A LA ADMINISTRACION DEL ESTADO ELABORAR Y APROBAR ... LAS REGLAMENTACIONES TECNICO-SANITARIAS ...>.

DE ESTOS PRECEPTOS, TOMADOS CONJUNTAMENTE, PARECE DEDUCIRSE UN APOYO LEGAL SUFICIENTE PARA QUE EL ESTADO REGULE LOS METODOS OFICIALES DE ANALISIS OTORGANDOLES EL CARACTER DE NORMA BASICA.

NO OBSTANTE Y, CON INDEPENDENCIA DE LOS CITADOS PRECEPTOS CON RANGO DE LEY FORMAL, EL CONJUNTO DE LA JURISPRUDENCIA SENTADA POR EL PROPIO TRIBUNAL CONSTITUCIONAL RELATIVA, ENTRE OTROS EXTREMOS, A LOS PRINCIPIOS DE <UNIDAD DE MERCADO>, <A LAS CONDICIONES BASICAS QUE GARANTICEN LA IGUALDAD DE TODOS LOS ESPAÑOLES>, Y, EN PARTICULAR, EN SU <DERECHO A LA SALUD>, O A LA <LIBRE CIRCULACION DE BIENES EN TODO EL TERRITORIO ESPAÑOL>, SE CONSIDERA QUE CONSTITUYE UN APOYO LEGAL AUN MAS FIRME, SI SE PIENSA QUE LA SANCION DE UNOS METODOS UNICOS Y UNIFORMES, QUE SIRVAN DE PAUTA APLICABLE AL ANALISIS DE LOS PRODUCTOS ALIMENTICIOS Y A LOS INDIRECTAMENTE RELACIONADOS CON ELLOS POR PARTE DE TODAS LAS ADMINISTRACIONES PUBLICAS, EN TODO EL TERRITORIO NACIONAL Y QUE, AL MISMO TIEMPO, PERMITA HOMOLOGAR LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON EL RESTO DE LOS PAISES COMUNITARIOS, DEBE RESERVARSE AL ESTADO COMO COMPETENCIA EXCLUSIVA.

EN SU VIRTUD, A PROPUESTA DE LOS MINISTROS DE ECONOMIA Y HACIENDA, DE INDUSTRIA Y ENERGIA, DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACION Y DE SANIDAD Y CONSUMO, PREVIO INFORME PRECEPTIVO DE LA COMISION INTERMINISTERIAL PARA LA ORDENACION ALIMENTARIA Y OIDOS LOS REPRESENTANTES DE LOS SECTORES AFECTADOS,

ESTE MINISTERIO DE RELACIONES CON LAS CORTES Y DE LA SECRETARIA DEL GOBIERNO DISPONE:

ARTICULO 1. SE APRUEBA EL METODO OFICIAL DE ANALISIS DE ACEITES Y GRASAS (ACIDO ERUCICO) QUE SE CITA EN EL ANEJO A LA PRESENTE ORDEN.

ART. 2. CUANDO NO EXISTAN METODOS OFICIALES PARA DETERMINADOS ANALISIS Y HASTA TANTO LOS MISMOS SEAN APROBADOS POR EL ORGANO COMPETENTE Y PREVIAMENTE INFORMADOS FAVORABLEMENTE POR LA COMISION INTERMINISTERIAL PARA LA ORDENACION ALIMENTARIA, PODRAN SER UTILIZADOS LOS APROBADOS POR LOS ORGANISMOS NACIONALES O INTERNACIONALES DE RECONOCIDA SOLVENCIA.

DISPOSICION ADICIONAL

LO DISPUESTO EN LA PRESENTE ORDEN POR LA QUE SE APRUEBAN LOS METODOS OFICIALES DE ANALISIS DE ACEITES Y GRASAS (ACIDO ERUCICO), SE CONSIDERA NORMA BASICA EN VIRTUD DE LO ESTABLECIDO EN EL ARTICULO 149.1.1. Y 16 DE LA CONSTITUCION ESPAÑOLA.

DISPOSICION DEROGATORIA

QUEDAN DEROGADAS CUANTAS DISPOSICIONES DE IGUAL O INFERIOR RANGO SE OPONGAN A LO ESTABLECIDO EN LA PRESENTE ORDEN.

MADRID, 31 DE ENERO DE 1989.

ZAPATERO GOMEZ

EXCMOS. SRES. MINISTROS DE ECONOMIA Y HACIENDA, DE INDUSTRIA Y ENERGIA, DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACION Y DE SANIDD Y CONSUMO.

ANEJO

59. ACIDO ERUCICO

59.1 PRINCIPIO. SEPARACION DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS GRASOS POR CROMATOGRAFIA EN LA CAPA FINA CON NITRATO DE PLATA Y DETERMINACION CUANTITATIVA DE LOS ESTERES ASI SEPARADOS POR CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA.

ESTE METODO PERMITE DETERMINAR EL CONTENIDO EN ACIDO ERUCICO DE:

A) LOS ACEITES Y GRASAS QUE CONTENGAN ACIDO CETOLEICO (ISOMERO CIS DEL ACIDO DOCOSENOICO, QUE SE ENCUENTRA EN LOS ACEITES DE PESCADO).

B) LOS ACEITES Y GRASAS HIDROGENADAS QUE CONTENGAN ISOMEROS CIS Y TRANS DEL ACIDO DOCOSENOICO.

59.2 MATERIAL Y APARATOS:

59.2.1 BALANZA ANALITICA CON UNA PRECISION DE 0,1 MILIGRAMOS.

59.2.2 EQUIPO DE CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA QUE INCLUYA:

59.2.2.1 CUBETAS DE DESARROLLO.

59.2.2.2 PLACAS DE VIDRIO DE 20 X 20 CENTIMETROS.

59.2.2.3 APLICADOR PARA DEPOSITAR LAS SOLUCIONES EN FORMA DE BANDA ESTRECHA O DE LINEA SOBRE PLACAS TLC.

59.2.3 UNIDAD DE CONGELACION CAPAZ DE MANTENER LA CUBETA DE DESARROLLO Y SU CONTENIDO A UNA TEMPERATURA ENTRE -20 C Y -25 C.

59.2.4 LAMPARA DE RAYOS U.V.

59.2.5 COLUMNAS DE VIDRIO DE 200 MILIMETROS DE LARGO Y 10 MILIMETROS DE DIAMETRO INTERNO, PROVISTAS DE FILTROS DE LANA DE VIDRIO O VIDRIO CALCINADO, O BIEN PEQUEÑOS EMBUDOS PROVISTOS DE FILTROS DE VIDRIO CALCINADO.

59.2.6 APARATO DE CROMATOGRAFIA DE GASES ACOPLADO A UN INTEGRADOR ELECTRONICO, TAL COMO SE DESCRIBE EN EL PUNTO 2 DEL APARTADO A.

59.3 REACTIVOS:

59.3.1 AGUA DESTILADA O DESMINERALIZADA DE PUREZA EQUIVALENTE.

59.3.2 ETER ETILICO RECIEN DESTILADO EXENTO DE PEROXIDOS.

59.3.3 N-HEXANO, REACTIVO PARA ANALISIS.

59.3.4 GEL DE SILICE G PARA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA.

59.3.5 GEL DE SILICE PARA CROMATOGRAFIA EN COLUMNA.

59.3.6 SOLUCION DE NITRATO DE PLATA DE 200 G/L. DISOLVER 24 GRAMOS DE NITRATO DE PLATA EN AGUA Y LLEVAR EL VOLUMEN A 120 MILILITROS CON AGUA.

59.3.7 SOLUCION DE ERUCATO DE METILO DE 5 MG/ML. DISOLVER 50 MILIGRAMOS DE ERUCATO DE METILO DE ALGUNOS MILILITROS DE N-HEXANO Y LLEVAR EL VOLUMEN A 10 MILILITROS CON N-HEXANO.

59.3.8 SOLUCION PATRON INTERNO DE TETRACOSAONATO DE METILO DE 0,25 MILIGRAMOS/MILILITROS.

DISOLVER 25 MILIGRAMOS DE TETRACOSAONATO DE METILO EN ALGUNOS MILILITROS DE N-HEXANO Y LLEVAR A 100 MILILITROS CON N-HEXANO.

59.3.9 LIQUIDO DE DESARROLLO: TOLUENO Y N-HEXANO 9:1 (V/V).

59.3.10 SOLUCION DE 2,7-DICLOROFLUORESCENO DE 0,5 G/LITRO. DISOLVER CALENTANDO Y AGITANDO 50 MILIGRAMOS DE 2,7-DICLOROFLUORESCENO EN 100 MILILITROS DE UNA SOLUCION METANOL-AGUA 1:1 (V/V).

59.4 PROCEDIMIENTO:

59.4.1 PREPARACION DE LA MUESTRA. LA MUESTRA DEBERA SER HOMOGENEIZADA ANTES DEL ANALISIS. LA MUESTRA ASI PREPARADA DEBERA CONSERVARSE SIEMPRE EN UN RECIPIENTE HERMETICO.

59.4.2 PREPARACION DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS GRASOS. TOMAR UNA MUESTRA DE UNOS 400 MILIGRAMOS DE LA GRASA O ACEITE Y PREPARAR UNA SOLUCION QUE CONTENGA ENTRE 20 Y 50 MILIGRAMOS/MILILITRO DE ESTERES METILICOS EN N-HEXANO, SIGUIENDO EL METODO EXPUESTO EN EL APARTADO B.

59.4.3 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA:

59.4.3.1 PREPARACION DE LAS PLACAS: COLOCAR 60 GRAMOS DE GEL DE SILICE (59.3.4) EN UN MATRAZ DE FONDO REDONDO DE 50 MILILITROS DE CAPACIDAD. AÑADIR 120 MILILITROS DE SOLUCION DE NITRATO DE PLATA (59.3.6) Y AGITAR DURANTE UN MINUTO PARA OBTENER UNA PASTA HOMOGENEA. EXTENDER ESTA DE LA MANERA HABITUAL SOBRE LAS PLACAS Y AJUSTAR EL ESPESOR DE LA CAPA A 0,5 MILIMETROS. DICHA CANTIDAD DE PASTA SERA SUFICIENTE PARA LA PREPARACION DE CINCO PLACAS DE 20 X 20 CENTIMETROS. SECAR PARCIALMENTE LAS PLACAS AL AIRE EN LA OSCURIDAD DURANTE TREINTA MINUTOS Y A CONTINUACION SECARLAS COMPLETAMENTE Y ACTIVARLAS EN UN HORNO A 100 C DURANTE DOS HORAS TREINTA MINUTOS.

LAS PLACAS DEBERAN UTILIZARSE EN CUANTO SEA POSIBLE TRAS LA FASE DE ACTIVACION, O BIEN GUARDARSE CUIDADOSAMENTE AL ABRIGO DE LA LUZ Y REACTIVANDOLAS ANTES DE VOLVERLAS A UTILIZAR. ANTES DE HACER USO DE ELLAS, TRAZAR SURCOS A TRAVES DEL SUBTRATO A 10 MILIMETROS DE LOS LADOS Y DE LA PARTE SUPERIOR DE CADA PLACA, A FIN DE DISMINUIR LOS EFECTOS MARGINALES DURANTE EL DESARROLLO (VER NOTA 2).

59.4.3.2 APLICACION DE LOS ESTERES METILICOS. CON AYUDA DEL APLICADOR (59.2.2.3) DEPOSITAR 50 ML DE LA SOLUCION DE ESTERES METILICOS PREPARADA A PARTIR DE LA MUESTRA, SOBRE UNA FINA LINEA DE UNOS 50 MILIMETROS DE LARGO, A 40 MILIMETROS COMO MINIMO DE LOS LADOS Y A 10 MILIMETROS DE LA PARTE INFERIOR DE LA PLACA. APLICAR DE LA MISMA MANERA 100 ML DE UNA SOLUCION QUE CONTENGA VOLUMENES IGUALES DE LA SOLUCION DE ESTERES METILICOS Y DE LA SOLUCION DE ERUCATO DE METILO (59.3.7).

TRAS LA APLICACION DE LOS ESTERES METILICOS (VER NOTA 3), COLOCAR LA PLACA EN UNA CUBETA CON ETER DIETILICO HASTA QUE SUBA EL FRENTE DE DESARROLLO A UNOS 5 MILIMETROS POR ENCIMA DE LA ZONA DE APLICACION. DICHA OPERACION CONCENTRARA LOS ESTERES METILICOS EN UNA BANDA ESTRECHA.

59.4.3.3 DESARROLLO DE LAS PLACAS. COLOCAR LA CUBETA CONTENIENDO EL LIQUIDO (59.3.9) EN LA UNIDAD DE CONGELACION (59.2.3) QUE SE HALLA A -25 C APROXIMADAMENTE (PODRA RESULTAR UTIL PROTEGER LA CUBETA DE LA LUZ CON ALGUN TIPO DE REVESTIMIENTO). TRANSCURRIDAS DOS HORAS, COLOCAR LA PLACA EN LA CUBETA CON PRECAUCION Y DEJAR SUBIR EL DISOLVENTE HASTA QUE ALCANCE UNA ZONA SITUADA ENTRE LA MITAD Y LOS DOS TERCIOS DE LA ALTURA DE LA PLACA. RETIRAR ESTA Y EVAPORAR LENTAMENTE EL DISOLVENTE CON AYUDA DE UNA CORRIENTE DE NITROGENO. VOLVER A COLOCAR LA PLACA EN LA CUBETA Y DEJAR QUE EL DISOLVENTE ALCANCE LA PARTE SUPERIOR DE LA PLACA. RETIRAR ESTA Y SECARLA DE NUEVO CON LA CORRIENTE DE NITROGENO, REVELANDOLA A CONTINUACION CON LA SOLUCION DE 2,7-DICLOROFLUORESCEINA (59.3.10) Y EXAMINAR A LA LUZ U.V. SE PODRA LOCALIZAR LA BANDA DE ERUCATO DE METILO PRESENTE EN LA MUESTRA POR REFERENCIA A LA BANDA MAS INTENSA DE LA MUESTRA A LA CUAL SE HA AÑADIDO EL ERUCATO DE METILO (VER FIGURA).

59.4.3.4 SEPARACION DE LAS FRACCIONES DE ESTERES METILICOS. RASPAR CUANTITATIVAMENTE LA BANDA DE ERUCATO DE METILO PROCEDENTE DE LA MUESTRA Y PASARLA A UN RECIPIENTE DE 59 MILILITROS DE CAPACIDAD (VER NOTA 7 Y FIGURA). RASPAR CUANTITATIVAMENTE LAS BANDAS QUE SE ENCUENTRAN POR ENCIMA Y LA QUE SE ENCUENTRA INMEDIATAMENTE POR DEBAJO DE LA BANDA DE ERUCATO DE METILO Y QUE CONTIENEN LAS DEMAS FRACCIONES DE ESTERES METILICOS DE ACIDOS GRASOS Y PASARLAS A OTRO RECIPIENTE DE 50 MILILITROS. EN CADA UNO DE LOS DOS RECIPIENTES VERTER 1,0 MILILITROS DE LA SOLUCION PATRON DE TETRACASAONATO DE METILO (59.3.8) Y 10 MILILITROS DE ETER DIETILICO (59.3.2). AGITAR Y TRANSFERIR SEPARADAMENTE EL CONTENIDO DE LOS RECIPIENTES A LAS CORRESPONDIENTES COLUMNAS O EMBUDOS (59.2.5), QUE CONTENDRAN APROXIMADAMENTE 1 GRAMO DE GEL DE SILICE (59.3.5). A CONTINUACION EXTRAER 3 O 4 VECES LOS ESTERES CON AYUDA DE 10 MILILITROS DE ETER DIETILICO. RECOGER EL PRODUCTO ELUIDO O FILTRADO SI ES CON EMBUDO, EN PEQUEÑOS MATRACES. TRAS HABER EVAPORADO UNA PARTE DEL DISOLVENTE CON CORRIENTE DE NITROGENO, TRANSFERIR LOS ESTERES METILICOS A MATRACES EN FORMA DE CORAZON.

EVAPORAR EL RESTO DEL DISOLVENTE CON CORRIENTE DE NITROGENO, DE MANERA QUE LOS ESTERES METILICOS SE CONCENTREN EN EL FONDO. DISOLVER LOS ESTERES METILICOS EN 25 A 50 ML DE N-HEXANO (59.3.3).

59.4.4 CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO:

59.4.4.1 SEGUIR LA METODICA DESCRITA EN EL APARTADO I E INYECTAR DE 1 A 2 ML DE LAS SOLUCIONES DE ESTERES METILICOS OBTENIDOS A PARTIR DE: A) LA FRACCION QUE CONTIENE EL ERUCATO DE METILO, Y B) LAS FRACCIONES QUE CONTIENEN EL RESTO DE LOS ESTERES METILICOS.

59.4.4.2 LAS AREAS DE LOS PICOS SUMINISTRADOS AL INTEGRADOR ELECTRONICO SON LAS SIGUIENTES:

A) A PARTIR DEL CROMATOGRAMA DE LA FRACCION QUE CONTIENE EL ERUCATO DE METILO:

1) ERUCATO DE METILO (E).

2) PATRON INTERNO (L 1 ).

3) AREAS TOTALES DE LOS PICOS DE LOS ESTERES METILICOS, EXCEPTUANDO EL PATRON INTERNO (EF).

B) A PARTIR DEL CROMATOGRAMA DE LA FRACCION QUE CONTIENE EL RESTO DE LOS ESTERES METILICOS:

1) AREAS TOTALES DE LOS PICOS, EXCEPTUANDO EL PATRON INTERNO (RF).

2) PATRON INTERNO (L 2 ).

59.5 EXPRESION DE RESULTADOS:

59.5.1 FORMULA Y METODO DE CALCULO:

59.5.1.1 EL CONTENIDO EN ACIDO ERUCICO DE LA MUESTRA, EXPRESADO EN PORCENTAJE DE ESTER METILICO DE LOS ESTERES METILICOS TOTALES, VIENE DADO POR LA FORMULA SIGUIENTE:

( FORMULA OMITIDA )

EN DONDE E, EF, RF, L 1 Y L 2 SON LAS AREAS DE LOS PICOS DEFINIDOS EN (59.4.4.2), CORREGIDAS, SI FUERA NECESARIO, POR FACTORES DE CALIBRACION. EL CONTENIDO DE ERUCATO DE METILO OBTENIDO MEDIANTE ESTA FORMULA ES EQUIVALENTE AL CONTENIDO DE ACIDO ERUCICO EXPRESADO EN PORCENTAJE DEL CONTENIDO TOTAL EN ACIDOS GRASOS.

59.5.1.2 SI EL AREA DE LOS PICOS ESTA EXPRESADA EN TANTO POR CIENTO, CALCULAR COMO SIGUE LOS VALORES EF Y RF:

EF = 100 L 1

RF = 100 - L 2

59.5.1.3 EL MODO DE CALCULO (59.5.1.1) SUPONE QUE EL CONTENIDO DE ACIDO TETRACOSANOICO DE LA MUESTRA ES DESPRECIABLE; CUANDO ESTO NO SEA ASI, EL VALOR DEL CONTENIDO DEL ACIDO TETRACOSANOICO (L 2 ) OBTENIDO DEL CROMATOGRAMA DE LAS FRACCIONES QUE CONTIENEN LOS OTROS ESTERES METILICOS, SE PUEDE REDUCIR A:

(FORMULA OMITIDA)

EN DONDE:

T 2 : AREA DEL PICO DEL ESTER METILICO DEL ACIDO TETRACOSANOICO PROVENIENTE DE LA MUESTRA, QUE CONSTITUYE UNA PARTE DE LA SUPERFICIE DEL PICO ATRIBUIDO AL PATRON INTERNO DEL CROMATOGRAMA DE LA FRACCION RESTANTE DE ESTERES METILICOS.

P 2 : AREA DEL PICO DEL ESTER METILICO DEL ACIDO PALMITICO OBTENIDO DEL CROMATOGRAMA DE LA FRACCION RESTANTE.

T O : AREA DEL PICO DEL ESTER METILICO DEL ACIDO TETRACOSANOICO OBTENIDO DEL CROMATOGRAMA DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS GRASOS TOTALES, DETERMINADOS SEGUN EL METODO DESCRITO EN EL APARTADO A.

P O : AREA DEL PICO DEL ESTER METILICO DEL ACIDO PALMITICO OBTENIDO DEL CROMATOGRAMA DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS GRASOS TOTALES, DETERMINADA SEGUN EL METODO DESCRITO EN EL APARTADO A.

59.5.1.4 ORIGEN DE LA FORMULA: EL CONTENIDO EN ACIDO GRASO DE LA FRACCION QUE CONTENGA EL ERUCATO DE METILO, EXPRESADO EN PORCENTAJE DEL CONTENIDO TOTAL DE ACIDOS GRASOS EN LA MUESTRA, VENDRA DADA POR:

(FORMULA OMITIDA )

EL CONTENIDO EN ACIDO ERUCICO DE LA FRACCION QUE CONTENGA EL ERUCATO DE METILO VENDRA DADA POR:

E/EF

DE DONDE RESULTA QUE EL CONTENIDO EN ACIDO ERUCICO DE LA MUESTRA, EXPRESADO EN PORCENTAJE DEL CONTENIDO TOTAL DE ACIDOS GRASOS, VENDRA DADO POR:

( FORMULA OMITIDA )

59.5.1.5 REPETIBILIDAD: LA DIFERENCIA ENTRE LOS RESULTADOS DE DOS DETERMINACIONES PARALELAS EFECTUADAS SIMULTANEAMENTE EN LAS MISMAS CONDICIONES POR EL MISMO ANALISTA SOBRE LA MISMA MUESTRA NO DEBERA SUPERAR, EN VALOR RELATIVO, EL 10 POR 100 DEL RESULTADO OBTENIDO Y, EN VALOR ABSOLUTO, 0,5 GRAMOS POR 100 GRAMOS DE MUESTRA TOMANDO EL VALOR MAS ELEVADO (VER NOTAS 4, 5 Y 6).

NOTAS:

1. EL PESO DE LA MUESTRA PRESENTADA AL LABORATORIO PARA SU ANALISIS DEBERA SER NORMALMENTE DE 50 GRAMOS, A MENOS QUE SEA NECESARIA UNA CANTIDAD MAYOR.

2. LA ACTIVACION A 110C DURANTE UNA HORA PODRA RESULTAR SATISFACTORIA A CONDICION DE QUE LAS PLACAS NO ESTEN ENNEGRECIDAS.

3. SI SE DESEARA PODRAN APLICARSE SOBRE LA PLACA 50 ML DE SOLUCION DE ERUCATO DE METILO, A FIN DE AYUDAR A SU IDENTIFICACION TRAS EL DESARROLLO (VER FIGURA).

4. RESULTADOS. EL RESULTADO, QUE SE INDICARA EN EL INFORME DEL ANALISTA SERA EL VALOR MEDIO OBTENIDO, COMO MINIMO, A PARTIR DE DOS DETERMINACIONES CUYA REPETIBILIDAD SEA SATISFACTORIA.

5.

CALCULO DEL PORCENTAJE. SALVO DISPOSICION ESPECIAL, LOS RESULTADOS SE EXPRESARAN EN PORCENTAJE (M/M) DE LOS ACIDOS GRASOS TOTALES EN LA MUESTRA EN EL ESTADO EN QUE ESTA HUBIESE LLEGADO AL LABORATORIO.

6. NUMERO DE CIFRAS SIGNIFICATIVAS. EL RESULTADO NO DEBERA INCLUIR MAS CIFRAS SIGNIFICATIVAS DE LAS QUE PERMITA LA PRECISION DEL METODO.

7. LA FRACCION INDICADA COMO ERUCATO DE METILO CONTENDRA NORMALMENTE ESTERES METILICOS DE OTROS ACIDOS MONOENOICOS, PERO DEBERA ESTAR EXENTA DE CETOLEATO DE METILO.

FIGURA

TIPICO EJEMPLO DE CROMATOGRAMA SOBRE CAPA DELGADA QUE MUESTRA LA SEPARACION DE LOS ESTERES METILICOS DEL ACIDO ERUCICO, DEL ACIDO CETOLEICO Y DE LOS ISOMEROS TRANS DEL ACIDO DOCOSENOICO

(FIGURA OMITIDA)

APARTADO A

CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA DE LOS ESTERES METILICOS

DE ACIDOS GRASOS

1. PREAMBULO. EL PRESENTE APARTADO TIENE POR OBJETO DAR LAS LINEAS DIRECTRICES BASICAS PARA LA DETERMINACION POR CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA DE LA COMPOSICION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE UNA MEZCLA DE ESTERES METILICOS DE ACIDOS GRASOS OBTENIDA SEGUN EL APARTADO B. LOS ACIDOS GRASOS POLIMERIZADOS NO SON ANALIZABLES POR ESTE METODO.

LAS INDICACIONES APORTADAS SE REFIEREN A LOS EQUIPOS NORMALES DE CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA CON COLUMNA DE RELLENO Y DETECTOR DE IONIZACION DE LLAMA (NOTA 1).

2. MATERIAL:

2.1 APARATO DE CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA: CUALQUIER EQUIPO QUE PERMITA ALCANZAR EL GRADO DE EFICACIA Y LA RESOLUCION TAL COMO SE DEFINEN EN EL PUNTO 4.2.1 ES VALIDO.

2.1.1 DISPOSITIVO DE INYECCION: EL DISPOSITIVO DE INYECCION DEBERA TENER EL VOLUMEN MUERTO MAS PEQUEÑO POSIBLE. SALVO IMPOSIBILIDAD MATERIAL, SE LE LLEVARA A UNA TEMPERATURA SUPERIOR EN 25 A 50C A LA DE LA COLUMNA.

2.1.2 HORNO: EL HORNO DEBERA SER CAPAZ DE LLEVAR LAS COLUMNAS A UNA TEMPERATURA DE AL MENOS 220C Y DE MANTENER LA TEMPERATURA ESCOGIDA CON PRECISION DE 1C.

EN CASO DE UTILIZACION DE TEMPERATURAS PROGRAMADAS, SE ACONSEJA ESCOGER UN APARATO DE DOBLE COLUMNA.

2.1.3 COLUMNA:

2.1.3.1 TUBO:

TUBO DE MATERIAL INERTE RESPECTO A LAS MATERIAS QUE DEBAN ANALIZARSE: CRISTAL O, EN SU DEFECTO, ACERO INOXIDABLE (NOTA 2).

LONGITUD: DE 1 A 3 METROS. SE UTILIZARA UNA COLUMNA RELATIVAMENTE CORTA EN LOS CASOS EN QUE ESTEN PRESENTES LOS ACIDOS GRASOS DE CADENA LARGA (>C 20 ).

EN LOS CASOS DE DETERMINACION DE LOS ACIDOS EN C 4 Y C 6 , SE RECOMIENDA UTILIZAR UNA COLUMNA DE 2 METROS.

DIAMETRO INTERIOR: DE 2 A 4 MILIMETROS.

2.1.3.2 RELLENO:

SOPORTE: TIERRA DE DIATOMEAS LAVADA CON ACIDO Y SILANIZADA, O CUALQUIER OTRO SOPORTE INERTE QUE SEA CONVENIENTE, CON UN ESTRECHO INTERVALO DE GRANULOMETRIA (25 MM ENTRE 125 Y 200 MM), ESTANDO LIGADO EL VALOR MEDIO AL DIAMETRO INTERIOR Y A LA LONGITUD DE LA COLUMNA.

FASE ESTACIONARIA: FASE POLAR DE TIPO POLIESTER (POR EJEMPLO POLISUCCINATO DE DIETILENOGLICOL, POLISUCCINATO DE BUTANEDIOL, POLIADIPATO DE ETILENOGLICOL, ETC.) O CUALQUIER OTRA FASE QUE RESPONDA A LAS EXIGENCIAS CITADAS A CONTINUACION (POR EJEMPLO, CIANOSILICONAS, ETC.). EL COEFICIENTE DE IMPREGNACION ESTARA COMPRENDIDO ENTRE EL 5 Y EL 20 POR 100, PARA DETERMINADAS SEPARACIONES PODRAN UTILIZARSE FASES APOLARES.

2.1.3.3 ACONDICIONAMIENTO: DESPUES DE HABER DESCONECTADO, SI FUERA POSIBLE, LA COLUMNA DEL DETECTOR, PONER EL HORNO DEL APARATO A 10C POR ENCIMA DE LA TEMPERATURA DE TRABAJO Y MANTENER LA COLUMNA QUE ACABE DE SER PREPARADA BAJO UNA CORRIENTE DE GAS INERTE DE 20 A 60 MILILITROS/MINUTO DURANTE AL MENOS DIECISEIS HORAS A DICHA TEMPERATURA Y DESPUES DURANTE DOS HORAS A 195C.

2.1.4 DETECTOR:

EL DETECTOR DEBERA, PREFERENTEMENTE, SER ADECUADO PARA LLEGAR A UNA TEMPERATURA SUPERIOR A LA DE LA COLUMNA.

LOS DETALLES OPERATORIOS DADOS A CONTINUACION SE REFIEREN AL EMPLEO DE UN DETECTOR DE IONIZACION DE LLAMA (NOTA 1).

2.2 JERINGA: JERINGA DE 10 ML COMO MAXIMO, DIVIDIDA EN DECIMAS DE ML.

2.3 APARATO REGISTRADOR: CUANDO SE UTILICE LA CURVA REGISTRADA PARA CALCULAR LA COMPOSICION DE LA MEZCLA ANALIZADA, EL APARATO REGISTRADOR DEBERA SER UN APARATO ELECTRONICO DE GRAN PRECISION COMPATIBLE CON EL EQUIPO UTILIZADO:

VELOCIDAD DE RESPUESTA INFERIOR A 1,5 SEGUNDOS, PREFERENTEMENTE A 1 SEGUNDO (LA VELOCIDAD DE RESPUESTA ES EL TIEMPO NECESARIO PARA QUE LA PLUMA DEL APARATO REGISTRADOR VAYA DEL 0 AL 90 POR 100 AL PRODUCIRSE LA INTRODUCCION MOMENTANEA DE UNA SEÑAL DEL 100 POR 100.

ANCHURA DEL PAPEL:

25 CENTIMETROS COMO MINIMO.

VELOCIDAD DEL PAPEL: 25 A 150 CENTIMETROS/HORA.

2.4 INTEGRADOR O CALCULADOR (OPCIONAL): EL EMPLEO DE UN INTEGRADOR ELECTRONICO O DE UN CALCULADOR PERMITE UN CALCULO RAPIDO Y PRECISO. ESTE CALCULO DEBERA SUMINISTRAR UNA RESPUESTA LINEAL, TENER UNA SENSIBILIDAD SUFICIENTE Y LA CORRECCION DE LA DESVIACION DE LA LINEA DE BASE DEBERA SER SATISFACTORIA.

3. REACTIVOS:

GAS PORTADOR: GAS INERTE (NITROGENO, HELIO, ARGON, ETC.) MUY BIEN DESECADO Y CONTENIENDO MENOS DE 10 PPM DE OXIGENO.

GASES AUXILIARES: HIDROGENO AL 99,9 POR 100 COMO MINIMO QUE NO CONTENGA PRODUCTOS ORGANICOS, AIRE Y OXIGENO QUE NO CONTENGA PRODUCTOS ORGANICOS.

PRODUCTOS PATRON: MEZCLA DE ESTERES METILICOS O ESTERES METILICOS DE UN ACEITE DE COMPOSICION CONOCIDA, A SER POSIBLE PARECIDA A LA DE LOS CUERPOS GRASOS QUE DEBAN ANALIZARSE.

4. METODO OPERATORIO:

4.1 REGLAJE DEL APARATO:

4.1.1 DETERMINACION DE LAS CONDICIONES OPTIMAS DE TRABAJO:

PARA ESCOGER LAS CONDICIONES DE TRABAJO, DEBERAN TENERSE EN CUENTA LAS SIGUIENTES VARIABLES:

LONGITUD Y DIAMETRO DE LA COLUMNA.

NATURALEZA Y CANTIDAD DE LA FASE ESTACIONARIA.

TEMPERATURA DE LA COLUMNA.

CAUDAL DEL GAS PORTADOR.

RESOLUCION DESEADA.

CONCENTRACION DE LA MUESTRA.

DURACION DEL ANALISIS.

LA IMPORTANCIA DE LA CANTIDAD DE MUESTRA SERA ESCOGIDA DE FORMA TAL QUE EL CONJUNTO DETECTOR-ELECTROMETRO SUMINISTRE UNA RESPUESTA LINEAL.

EN GENERAL, LOS SIGUIENTES VALORES SERAN LOS QUE DEN LOS RESULTADOS DESEADOS, A SABER, NUMERO DE PLATOS TEORICOS PARA EL ESTEARATO DE METILO AL MENOS IGUAL A 2.000 Y ELUCION DE ESTE EN APROXIMADAMENTE QUINCE MINUTOS:

DIAMETRO INTERIOR DE LA COLUMNA / VELOCIDAD DEL GAS PORTADOR

2 MILIMETROS 15-25 MILILITROS/MINUTO

3 MILIMETROS 20-40 MILILITROS/MINUTO

4 MILIMETROS 40-60 MILILITROS/MINUTO

CONCENTRACION DE LA FASE ESTACIONARIA / TEMPERATURA

5 POR 100 175 C

10 POR 100 180 C

15 POR 100 185 C

20 POR 100 185 C

CUANDO EL APARATO LO PERMITA, ESTARA EL INYECTOR A UNA TEMPERATURA CERCANA A LOS 200C Y EL DETECTOR A UNA TEMPERATURA IGUAL O SUPERIOR A LA DE LA COLUMNA.

EL CAUDAL DE HIDROGENO DEL DETECTOR DE IONIZACION DE LLAMA ES, EN GENERAL, DE CERCA DE LA MITAD DEL GAS PORTADOR Y EL DE OXIGENO ES DE 5 A 10 VECES EL DEL HIDROGENO.

4.1.2 DETERMINACION DE LA EFICACIA Y DE LA RESOLUCION:

EFECTUAR EL ANALISIS DE UNA MEZCLA DE ESTEARATO Y DE OLEATO DE METILO EN PROPORCIONES SENSIBLEMENTE EQUIVALENTES (POR EJEMPLO, ESTERES METILICOS DE MANTECA DE CACAO). LA IMPORTANCIA DE LA CONCENTRACION DE MUESTRA, LA TEMPERATURA DE LA COLUMNA Y EL CAUDAL DEL GAS PORTADOR SE ESCOGERAN DE MANERA QUE EL MAXIMO DEL PICO DE ESTEARATO DE METILO SE REGISTRE ALREDEDOR DE QUINCE MINUTOS DESPUES DEL PICO DEL DISOLVENTE Y QUE DICHO PICO CORRESPONDA APROXIMADAMENTE A LOS TRES CUARTOS DE LA ESCALA TOTAL.

CALCULAR EL NUMERO DE PLATOS TEORICOS N (EFICACIA) MEDIANTE LA FORMULA:

(FORMULA Y RESOLUCION R POR LA FORMULA OMITIDAS)

DONDE:

DR 1 ES LA DISTANCIA DE RETENCION EN MILIMETROS MEDIDA A PARTIR DE LA INTRODUCCION HASTA EL MAXIMO RELATIVO DEL PICO DE ESTEARATO DE METILO.

V1 Y V2 SON LAS ANCHURAS EN MILIMETROS DE LOS PICOS DEL ESTEARATO Y DEL OLEATO DE METILO MEDIDAS ENTRE LOS PUNTOS DE INFLEXION DE LA CURVA.

D ES LA DISTANCIA ENTRE LOS MAXIMOS RELATIVOS DE LOS PICOS DEL ESTEARATO Y DEL OLEATO DE METILO.

(FIGURA OMITIDA)

LAS CONDICIONES DE OPERACION QUE SE TOMARAN EN CONSIDERACION SERAN LAS QUE DEN UN NUMERO DE PLATOS TEORICOS PARA EL ESTEARATO DE METILO AL MENOS IGUAL A 2.000 Y UNA RESOLUCION DE AL MENOS 1,25. DEBERAN, ADEMAS, SER TALES QUE EL ACIDO LINOLENICO (C 18:3 ) SEA SEPARADO DE LOS ACIDOS ARAQUICO (C 20:0 ) Y GACOLEICO (C 20:1 )

4.2 ANALISIS: EL VOLUMEN DE MUESTRA SERA DE 0,1 A 2 ML DE LA SOLUCION HEPTANICA DE LOS ESTERES METILICOS OBTENIDA EN EL APARTADO B. EN LOS CASOS DE ESTERES EXENTOS DE DISOLVENTES, HACER UNA SOLUCION AL 10 POR 100 APROXIMADAMENTE EN HEPTANO E INYECTAR DE 0,1 A

1 ML DE ESTA.

PARA LA BUSQUEDA DE COMPONENTES PRESENTES EN TRAZAS, ESTA TOMA DE MUESTRAS PODRA AUMENTARSE HASTA 10 VECES; EN LOS CASOS HABITUALES, LAS CONDICIONES DE OPERACION SERAN LAS DETERMINADAS EN EL PUNTO 4.1.1. SIN EMBARGO, SERA POSIBLE OPERAR CON UNA TEMPERATURA DE COLUMNA MAS BAJA EN EL CASO EN QUE SEA NECESARIO DOSIFICAR ACIDOS GRASOS INFERIORES A C 12 , O MAS ELEVADA EN EL CASO EN QUE FUERA NECESARIO DOSIFICAR ACIDOS GRASOS SUPERIORES A C 20

EN SU CASO, ES POSIBLE OPERAR A UNA TEMPERATURA PROGRAMADA EN LOS DOS CASOS PRECEDENTES. POR EJEMPLO, SI LA MUESTRA CONTUVIERA ESTERES METILICOS DE ACIDOS GRASOS DE MENOS DE 12 ATOMOS DE CARBONO, INYECTAR LA MUESTRA A 100 C (O A 50-60 C SI EL ACIDO BUTIRICO ESTUVIERA PRESENTE) Y PROGRAMAR INMEDIATAMENTE A 4-8 C/MINUTO HASTA LA TEMPERATURA OPTIMA.

EN DETERMINADOS CASOS, PODRAN COMBINARSE LOS DOS PROCEDIMIENTOS:

DESPUES DEL PERIODO DE PROGRAMACION DE TEMPERATURA, CONTINUAR LA ELUCION A TEMPERATURA CONSTANTE HASTA LA ELUCION DE TODOS LOS CONSTITUYENTES. SI EL APARATO NO PUDIERA TRABAJAR A TEMPERATURA PROGRAMADA, OPERAR A DOS TEMPERATURAS FIJADAS ENTRE 100 Y 195 C.

SI FUERA NECESARIO, SE RECOMIENDA HACER UN ANALISIS SOBRE DOS FASES FIJAS DE POLARIDADES DIFERENTES PARA COMPROBAR LA AUSENCIA DE PICOS OCULTOS, POR EJEMPLO PARA LOS ACEITES DE PESCADO O EN EL CASO DE LA PRESENCIA SIMULTANEA DE C 18:3 Y C 20 Y DE C 18:3 Y DE C 18:2 CONJUGADOS.

5. EXPRESION DE LOS RESULTADOS:

5.1 ANALISIS CUALITATIVO: EN CONDICIONES DE OPERACION IDENTICAS A LAS DEL ENSAYO, ANALIZAR LA MEZCLA TESTIGO, DE COMPOSICION CONOCIDA, Y DETERMINAR LAS DISTANCIAS DE RETENCION (O LOS TIEMPOS DE RETENCION) PARA LOS ACIDOS GRASOS CONSTITUTIVOS. TRAZAR LAS CURVAS QUE DEN EL LOGARITMO DE LA DISTANCIA DE RETENCION (O DEL TIEMPO DE RETENCION) EN FUNCION DEL NUMERO DE ATOMOS DE CARBONO; EN CONDICIONES ISOTERMAS Y PARA LOS ESTERES DE CADENA RECTA Y UN INDICE DE INSATURACION FIJADO, DICHAS CURVAS TRAZADAS SOBRE PAPEL SEMILOGARITMICO DEBERAN SER RECTAS NOTABLEMENTE PARALELAS.

PARA LA PRUEBA, IDENTIFICAR LOS PICOS REMITIENDOSE A DICHAS RECTAS, SI FUERA NECESARIO INTERPOLANDO.

DEBERAN EVITARSE LAS CONDICIONES OPERATIVAS EN LAS QUE EXISTAN <PICOS OCULTOS>, O SEA, QUE DOS CONSTITUYENTES NO PUEDAN DISTINGUIRSE COMO CONSECUENCIA DE UNA RESOLUCION INSUFICIENTE.

5.2 ANALISIS CUANTITATIVO:

5.2.1 DETERMINACION DE LA COMPOSICION:

UTILIZAR EL METODO DE NORMALIZACION INTERNA (SALVO EXCEPCIONES), O SEA, ADMITIR QUE LA TOTALIDAD DE LOS CONSTITUYENTES PRESENTES EN LA MUESTRA ESTA REPRESENTADA SOBRE EL CROMATOGRAMA, Y POR TANTO QUE LA SUMA DE LAS AREAS DE LOS PICOS REPRESENTA UN 100 POR 100 DE LOS CONSTITUYENTES (ELUCION TOTAL).

SI EL EQUIPO INCLUYE UN INTEGRADOR, UTILIZAR LAS CIFRAS SUMINISTRADAS POR EL. EN CASO CONTRARIO, DETERMINAR EL AREA DE CADA PICO POR TRIANGULACION MULTIPLICANDO LA ALTURA DE ESTE POR SU ANCHURA A MEDIA ALTURA, CONSIDERANDO, SI FUERA NECESARIO, LAS DIVERSAS ATENUACIONES UTILIZADAS EN EL CURSO DEL REGISTRO.

5.2.1.1 CASO GENERAL: A FALTA DE CONSTITUYENTES IMPORTANTES INFERIORES A C 8 , CALCULAR EL CONTENIDO EN CONSTITUYENTE, EXPRESADO EN PORCENTAJE EN ESTERES METILICOS, DETERMINANDO EL PORCENTAJE REPRESENTADO POR EL AREA DEL PICO CORRESPONDIENTE CON RESPECTO A LA SUMA DE LA TOTALIDAD DE LOS PICOS:

PORCENTAJE (M/M) DEL COMPUESTO I EXPRESADO EN ESTERES METILICOS =

(FORMULA OMITIDA)

5.2.1.2 EMPLEO DE FACTORES DE CORRECCION:

EN ALGUNOS CASOS, EN ESPECIAL EN PRESENCIA DE ACIDOS INFERIORES A C 8 O DE ACIDOS DE FUNCIONES SECUNDARIAS Y CUANDO SE UTILICEN DETECTORES DE CONDUCTIBILIDAD TERMICA, PROCEDERA UTILIZAR FACTORES DE CORRECCION PARA CONVERTIR LOS PORCENTAJES DE LAS AREAS DE LOS PICOS EN PORCENTAJES EN MASA DE LOS CONSTITUYENTES.

DETERMINAR LOS FACTORES DE CORRECCION CON LA AYUDA DE UN CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE UNA MEZCLA TESTIGO DE ESTERES METILICOS DE COMPOSICION EXACTAMENTE CONOCIDA EN CONDICIONES OPERATIVAS IDENTICAS A LAS DE LA PRUEBA.

PARA DICHA MEZCLA TESTIGO:

(FORMULAS OMITIDAS)

5.2.1.3 EMPLEO DE UN PATRON INTERNO: EN DETERMINADOS CASOS (EN ESPECIAL CUANTIFICACION DE LOS ACIDOS C 4 Y C 6 Y CUANTIFICACION DE LOS ACIDOS EN CASO DE QUE TODOS LOS ACIDOS GRASOS NO ESTEN ELUIDOS) PROCEDERA UTILIZAR UN PATRON INTERNO (RESPECTIVAMENTE C 5 Y C 15 O C 17 ) Y, A CONTINUACION, DETERMINAR EL FACTOR DE CORRECCION DEL MISMO.

PORCENTAJE (M/M) DEL COMPUESTO I EXPRESADO EN ESTERES METILICOS =

(FORMULA OMITIDA)

M S = PESO DEL PATRON INTERNO EN MG,

M = PESO DE LA MUESTRA EN MG,

K S = FACTOR DE CORRECCION DEL PATRON INTERNO,

A S = AREA DEL PICO CORRESPONDIENTE AL PATRON INTERNO,

A Z = AREA DEL PICO CORRESPONDIENTE AL COMPUESTO I.

5.2.2 EXPRESION DE LOS RESULTADOS: DAR EL RESULTADO CON:

TRES CIFRAS SIGNIFICATIVAS POR ENCIMA DEL 10 POR 100.

DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS EN EL 1 Y EL 10 POR 100.

UNA CIFRA SIGNFICATIVA POR DEBAJO DEL 1 POR 100.

O SEA, EN CADA CASO, CON UNA CIFRA DESPUES DE LA COMA.

5.2.3 REPETIBILIDAD: LA DIFERENCIA ENTRE LOS RESULTADOS DE DOS DETERMINACIONES EFECTUADAS EL MISMO DIA, CON EL MISMO APARATO, POR LA MISMA PERSONA Y SOBRE LOS MISMOS ESTERES Y PARA LOS CONSTITUYENTES PRESENTES EN MAS DEL 5 POR 100, NO DEBERA EXCEDER EN VALOR RELATIVO DEL 3 POR 100 DEL VALOR DETERMINADO, CON UN MAXIMO ABSOLUTO DEL 1 POR 100.

PARA LOS CONSTITUYENTES PRESENTES EN MENOS DEL 5 POR 100, LA REPETIBILIDAD SE HACE RAPIDAMENTE MENOS BUENA, EN VALOR RELATIVO, A MEDIDA QUE EL CONTENIDO DISMINUYE.

5.2.4 REPRODUCTIBILIDAD: LA DIFERENCIA ENTRE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN DOS LABORATORIOS DIFERENTES PARA LOS CONSTITUYENTES PRESENTES EN MAS DEL 5 POR 100 NO DEBERA EXCEDER EN VALOR RELATIVO DEL 10 POR 100 DEL VALOR DETERMINADO, CON UN MAXIMO ABSOLUTO DEL 3 POR 100.

PARA LOS CONSTITUYENTES PRESENTES EN MENOS DEL 5 POR 100, LA REPRODUCTIBILIDAD SE HACE RAPIDAMENTE MENOS BUENA, EN VALOR RELATIVO, A MEDIDA QUE DISMINUYE EL CONTENIDO.

6. NOTAS:

1. PODRA EMPLEARSE UN APARATO DE CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA CON UN DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD TERMICA (CATAROMETRO). LAS CONDICIONES DESCRITAS SE MODIFICARAN ENTONCES DE LA SIGUIENTE MANERA:

TUBO: LONGITUD, 2 A 4 METROS; DIAMETRO INTERIOR: 4 MILIMETROS.

SOPORTE: GRANULOMETRIA ENTRE 160 Y 200 MM.

INDICE DE IMPREGNACION: DEL 15 AL 20 POR 100.

GAS PORTADOR: HELIO O, EN SU DEFECTO, HIDROGENO, CON UN CONTENIDO EN OXIGENO TAN DEBIL COMO SEA POSIBLE.

NINGUN GAS AUXILIAR.

TEMPERATURA DEL INYECTOR: 40 A 60 C SUPERIOR A LA DE LA COLUMNA.

TEMPERATURA DE LA COLUMNA: DE 180 A 200 C.

CAUDAL DEL GAS PORTADOR:

GENERALMENTE COMPRENDIDO ENTRE 60 Y 80 ML/MIN.

CANTIDADES INYECTADAS:

GENERALMENTE ENTRE 0,5 Y 2 ML.

PARA EL ANALISIS CUANTITATIVO, TOMAR EN CONSIDERACION LOS FACTORES DE CORRECCION DEFINIDOS EN EL PUNTO 5.2.1.2.

2. SI ESTUVIERAN PRESENTES CONSTITUYENTES POLIINSATURADOS DE MAS DE 3 DOBLES ENLACES, UN TUBO DE ACERO INOXIDABLE PODRIA PROVOCAR SU DESCOMPOSICION.

APARTADO B

METODO DE PREPARACION DE LOS ESTERES METILICOS DE ACIDOS GRASOS QUE TENGAN SEIS ATOMOS DE CARBONO Y MAS

EN EL PUNTO 1 SE DA UN METODO GENERAL DE PREPARACION DE LOS ESTERES METILICOS UTILIZANDO EL TRIFLUORURO DE BORO QUE DEBERA ADOPTARSE CON CARACTER PREFERENTE. POR SI NO FUERE POSIBLE UTILIZAR DICHO METODO, SE DESCRIBEN METODOS ALTERNATIVOS EN EL PUNTO 2.

1. METODO GENERAL UTILIZANDO DEL TRIFLUORURO DE BORO:

1.1. PRINCIPIO: SAPONIFICACION DE LOS GLICERIDOS Y LIBERACION Y ESTERIFICACION DE LOS ACIDOS GRASOS EN PRESENCIA DE TRIFLUORURO DE BORO.

1.2 MATERIAL:

MATRACES DE 50 A 100 MILILITROS DE CUELLO ESMERILADO.

REFRIGERANTE RECTO, DE 20 A 30 CENTIMETROS DE LONGITUD UTIL, CON ESMERILADO ADAPTABLE AL MATRAZ.

REGULADOR DE EBULLICION, EXENTO DE GRASA.

TUBO PARA BURBUJEO DE NITROGENO.

PIPETA GRADUADA DE UNA CAPACIDAD AL MENOS IGUAL A 10 MILILITROS, Y PERILLA PARA PIPETA O PIPETA AUTOMATICA.

TUBOS DE ENSAYO DE TAPON ESMERILADO.

AMPOLLAS DE DECANTACION DE 250 MILILITROS.

1.3 REACTIVOS:

SOLUCION METANOLICA DE HIDROXIDO DE SODIO DE ALREDEDOR DE 0,5 N: DISOLVER 2 GRAMOS DE HIDROXIDO DE SODIO EN 100 MILILITROS DE METANOL QUE NO CONTENGA MAS DEL 0,5 POR 100 (M/M) DE AGUA. CUANDO SE DEBA UTILIZAR LA SOLUCION DURANTE UN PERIODO DE TIEMPO CONSIDERABLEMENTE LARGO SE FORMARA UN POCO DE CARBONATO DE SODIO (PRECIPITADO BLANCO); ESTE NO TENDRA NINGUNA INFLUENCIA SOBRE LA PREPARACION DE LOS ESTERES METILICOS.

SOLUCION METANOLICA DE TRIFLUORURO DE BORO DE CONTENIDO COMPRENDIDO ENTRE EL 12 Y 15 POR 100 (M/M).

(EXISTEN SOLUCIONES AL 14 Y 50 POR 100 EN EL COMERCIO) (NOTA 2).

ADVERTENCIA: EL TRIFLUORURO DE BORO ES UN COMPUESTO TOXICO. POR ELLO NO SE RECOMIENDA PREPARAR UNO MISMO LA SOLUCION A PARTIR DE TRIFLUORURO DE BORO Y DE METANOL (NOTA 3):

HEPTANO, PARA CROMATOGRAFIA (NOTA 2, NOTA 4).

ETER DE PETROLEO BIDESTILADO (EB 40-60 C), INDICE DE BROMO INFERIOR A 1 EXENTO DE RESIDUO O HEXANO (NOTA 2).

SULFATO DE SODIO ANHIDRO.

SOLUCION SATURADA DE CLORURO DE SODIO.

ROJO DE METILO, EN SOLUCION AL 0,1 POR 100 (M/M) EN ETANOL AL 60 POR 100 (V/V).

NITROGENO QUE CONTENGA MENOS DE 5 MILIGRAMOS DE OXIGENO POR KILOGRAMO.

1.4 METODO OPERATORIO: LAS OPERACIONES SIGUIENTES SE EFECTUARAN PREFERENTEMENTE BAJO UNA CAMPANA DE GASES A CAUSA DE LAS PROPIEDADES TOXICAS DEL TRIFLUORURO DE BORO. TODO EL MATERIAL DE VIDRIO SE LAVARA CON AGUA INMEDIATAMENTE DESPUES DE SU EMPLEO.

EN PRESENCIA DE ACEITES O DE ACIDOS GRASOS QUE CONTENGAN ACIDOS DE MAS DE DOS DOBLES ENLACES SE RECOMIENDA ELIMINAR EL AIRE CONTENIDO EN EL METANOL Y EN EL MATRAZ POR BURBUJEO DE NITROGENO DURANTE ALGUNOS MINUTOS.

NO ES NECESARIA UNA PESADA EXACTA. EL TAMAÑO DE LA TOMA DE MUESTRA SOLO HA DE CONOCERSE PARA ESCOGER EL TAMAÑO DEL MATRAZ Y LAS CANTIDADES DE REACTIVOS SEGUN EL SIGUIENTE CUADRO:

MUESTRA (MG) / MATRAZ (ML) / NAOH 0,5 N (ML) / SOLUCION METANOLICA DE BF 3 (ML)

100-250 50 4 5

250-500 50 6 7

500-750 100 8 9

750-1.000 100 10 12

EN CASO DE QUE LOS ESTERES METILICOS ESTEN DESTINADOS AL ANALISIS POR CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA, LA MUESTRA SERA PREFERENTEMENTE DE ALREDEDOR DE 350 MILIGRAMOS. SI FUERE MAS PEQUEÑA, CONVENDRA TOMAR PRECAUCIONES PARA QUE LA MUESTRA TOMADA SEA REPRESENTATIVA (NOTA 5).

1.4.1 PARA LOS ACEITES Y GRASAS:

INTRODUCIR LA MUESTRA PREPARADA EN EL MATRAZ. AÑADIR LA CANTIDAD INDICADA DE LA SOLUCION METANOLICA DE HIDROXIDO DE SODIO Y UN REGULADOR DE EBULLICION. ADAPTAR EL REFRIGERANTE SOBRE EL MATRAZ. LLEVAR A EBULLICION CON REFLUJO HASTA QUE DESAPAREZCAN LAS GOTITAS DE MATERIA GRASA (ESTA OPERACION PUEDE DURAR DE CINCO A DIEZ MINUTOS, PERO, EN ALGUNOS CASOS EXCEPCIONALES, PUEDE SOBREPASAR LOS DIEZ MINUTOS).

AÑADIR A LA MEZCLA EN EBULLICION POR LA PARTE SUPERIOR DEL REFRIGERANTE Y UTILIZANDO LA PIPETA GRADUADA CON LA PERA PARA PIPETA O LA PIPETA AUTOMATICA LA CANTIDAD INDICADA DE LA SOLUCION METANOLICA DE TRIFLUORURO DE BORO. CONTINUAR LA EBULLICION DURANTE DOS MINUTOS.

AÑADIR A LA MEZCA HIRVIENDO DE 2 A 5 MILILITROS DE HEPTANO (NOTA 4) POR LA PARTE SUPERIOR DEL REFRIGERANTE (LA CANTIDAD DE HEPTANO NO TIENE IMPORTANCIA EN LA REACCION) Y CONTINUAR LA EBULLICION DURANTE UN MINUTO.

QUITAR LA FUENTE DE CALOR DEL MATRAZ Y DESPUES EL REFRIGERANTE. AÑADIR ALGUNOS MILILITROS DE LA SOLUCION SATURADA DE CLORURO DE SODIO Y AGITAR SUAVEMENTE EL MATRAZ VARIAS VECES POR ROTACION.

CONTINUAR AÑADIENDO SOLUCION SATURADA DE CLORURO DE SODIO PARA LLEVAR EL NIVEL DEL LIQUIDO AL CUELLO DEL MATRAZ.

TRASLADAR ALREDEDOR DE 1 MILILITRO DE LA CAPA SUPERIOR (SOLUCION HEPTANICA) A UN TUBO DE ENSAYO ESMERILADO Y AÑADIR LA CANTIDAD DE SULFATO DE SODIO ANHIDRO NECESARIA PARA ELIMINAR LOS RESTOS DE AGUA. EN EL CASO DE UNA MUESTRA DE 350 MILIGRAMOS, LA SOLUCION OBTENIDA CONTENDRA ALREDEDOR DEL 5 AL 10 POR 100 DE ESTERES METILICOS Y PODRA INYECTARSE DIRECTAMENTE EN LA COLUMNA DE CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA. EN LOS OTROS CASOS DILUIR LA SOLUCION HEPTANICA PARA OBTENER UNA CONCENTRACION DEL 5 AL 10 POR 100 EN ESTERES METILICOS (NOTA 6).

PARA OBTENER LA TOTALIDAD DE LOS ESTERES SECOS, TRASLADAR LA SOLUCION Y LA FASE HEPTANICA A UNA AMPOLLA DE DECANTACION DE 250 MILILITROS. DECANTAR. EXTRAER LA SOLUCION SALINA CON 50 MILILITROS DE ETER DE PETROLEO (EB 40-50 C) O DE HEXANO.

REPETIR UNA SEGUNDA VEZ ESTA EXTRACCION. REUNIR LA FASE HEPTANICA Y LOS DOS EXTRACTOS Y LAVARLOS CON PORCIONES DE 20 MILILITROS DE AGUA HASTA LA DESAPARICION DE LA ACIDEZ (INDICADOR: ROJO DE METILO). SECAR CON SULFATO DE SODIO ANHIDRO Y EVAPORAR EL DISOLVENTE AL BAÑO MARIA BAJO CORRIENTE DE NITROGENO (NOTA 6 Y NOTA 7). PARA MUESTRAS INFERIORES A 500 MILIGRAMOS, ES PREFERIBLE REDUCIR PROPORCIONALMENTE LOS VOLUMENES DE DISOLVENTE Y DE AGUA.

1.4.2 PARA ACIDOS GRASOS:

SI LA MUESTRA ESTA CONSTITUIDA UNICAMENTE POR ACIDOS GRASOS NO SE EFECTUA LA SAPONIFICACION.

INTRODUCIR LA CANTIDAD DESEADA DE ACIDOS GRASOS PREPARADOS EN EL MATRAZ. AÑADIR LA CANTIDAD INDICADA DE LA SOLUCION METANOLICA DE TRIFLUORURO DE BORO. LLEVAR A EBULLICION DURANTE DOS MINUTOS. PROCEDER A CONTINUACION COMO SE INDICA EN EL PUNTO 1.4.4 A PARTIR DE:

<AÑADIR A LA MEZCLA HIRVIENDO...>.

2. METODOS ALTERNATIVOS NO UTILIZANDO EL TRIFLUORURO DE BORO:

2.1 PARA LOS CUERPOS GRASOS NEUTROS (IA < 2):

2.1.1 PRINCIPIO: METANOLISIS DE LOS GLICERIDOS EN MEDIO ALCALINO.

2.1.2 MATERIAL:

AGITADOR QUE PERMITA UNA AGITACION RAPIDA Y DISPOSITIVO DE CALENTAMIENTO APROPIADO (POR EJEMPLO, AGITADOR MAGNETICO-CALENTADOR).

ERLENMEYER O MATRAZ DE 100 MILILITROS DE CUELLO ESMERILADO.

TUBO PARA BURBUJEO DE NITROGENO.

REFRIGERANTE QUE SE ADAPTE AL MATRAZ O AL ERLENMEYER.

REGULADOR DE EBULLICION, EXENTO DE GRASA.

AMPOLLAS DE DECANTACION DE 125 MILILITROS.

ERLENMEYER, DE BOCA ESTRECHA, DE 50 MILILITROS.

2.1.3 REACTIVOS:

METANOL QUE NO CONTENGA MAS DE 0,5 POR 100 (M/M) DE AGUA.

SOLUCION METANOLICA DE HIDROXIDO DE POTASIO DE ALREDEDOR DE 1 N:

DISOLVER 5,6 GRAMOS DE HIDROXIDO DE POTASIO EN 100 MILILITROS DE METANOL QUE NO CONTENGA MAS DEL 0,5 POR 100 (M/M) DE AGUA.

HEPTANO PARA CROMATOGRAFIA (NOTA 2 Y NOTA 4).

SULFATO DE SODIO ANHIDRO.

NITROGENO QUE CONTENGA MENOS DE 5 MILIGRAMOS DE OXIGENO POR KILOGRAMO.

2.1.4 METODO OPERATORIO:

EN PRESENCIA DE ACEITES QUE CONTENGAN ACIDOS DE MAS DE 2 DOBLES ENLACES ES RECOMENDABLE ELIMINAR EL AIRE CONTENIDO EN EL METANOL Y EL MATRAZ MEDIANTE BURBUJEO DE NITROGENO DURANTE ALGUNOS MINUTOS.

EN UN ERLENMEYER O UN MATRAZ DE 100 MILILITROS, INTRODUCIR ALREDEDOR DE 4 GRAMOS (NOTA 5) DE CUERPO GRASO PREPARADO. AÑADIR ALREDEDOR DE 40 MILILITROS DE METANOL, 0,5 MILILITROS DE LA SOLUCION DE HIDROXIDO DE POTASIO Y UN REGULADOR DE EBULLICION. PONER BAJO REFRIGERANTE A REFLUJO, AGITAR Y LLEVAR A EBULLICION. LA SOLUCION DEBE HACERSE LIMPIDA. LA REACCION ESTARA PRACTICAMENTE TERMINADA AL CABO DE CINCO A DIEZ MINUTOS. EN CASO DE ACEITES DEL TIPO <ACEITE DE RICINO>, LA LIMPIDEZ NO SERA EL CRITERIO DE REACCION (NOTA 8).

REFRIGERAR BAJO CORRIENTE DE AGUA Y TRASVASAR A UNA AMPOLLA DE DECANTACION DE 125 MILILITROS. ENJUAGAR EL ERLENMEYER O EL MATRAZ CON 20 MILILITROS DE HEPTANO (NOTA 4) Y VERTERLOS EN LA AMPOLLA.

AÑADIR ALREDEDOR DE 40 MILILITROS DE AGUA, AGITAR Y DEJAR DECANTAR.

LOS ESTERES SE REUNIRAN EN LA FASE HEPTANICA SUPERIOR. EXTRAER LA FASE ACUOSA UNA SEGUNDA VEZ CON 20 MILILITROS DE HEPTANO. REUNIR LOS DOS EXTRACTOS Y LAVARLOS DOS VECES CON 20 MILILITROS DE AGUA. DESPUES DE LA DECANTACION, SECAR SOBRE SULFATO DE SODIO ANHIDRO LA SOLUCION DE ESTERES, FILTRAR SOBRE ALGODON Y EVAPORAR EL DISOLVENTE, SI FUERA NECESARIO, HASTA 20 MILILITROS EN BAÑO DE AGUA HIRVIENDO BURBUJEANDO NITROGENO EN UN ERLENMEYER DE 50 MILILITROS (NOTA 6, NOTA 7).

2.2 PARA LOS CUERPOS GRASOS ACIDOS (IA > 2) Y ACIDOS GRASOS:

2.2.1 PRINCIPIO:

PARA LOS CUERPOS GRASOS ACIDOS, NEUTRALIZACION DE LOS ACIDOS GRASOS LIBRES, METANOLISIS ALCALINA DE LOS GLICERIDOS Y ESTERIFICACION POSTERIOR DE LOS ACIDOS GRASOS EN MEDIO ACIDO.

PARA LOS ACIDOS GRASOS, ESTERIFICACION EN MEDIO ACIDO.

2.2.2 MATERIAL:

AGITADOR QUE PERMITA UNA AGITACION RAPIDA Y DISPOSITIVO DE CALENTAMIENTO APROPIADO (POR EJEMPLO, AGITADOR MAGNETICO-CALENTADOR).

ERLENMEYER O MATRAZ DE 250 MILILITROS DE CUELLO ESMERILADO.

TUBO PARA BURBUJEO DE NITROGENO.

REFRIGERANTE QUE SE ADAPTE AL ERLENMEYER O AL MATRAZ.

REGULARIZADOR DE EBULLICION, EXENTO DE GRASA.

AMPOLLAS DE DECANTACION DE 250 MILILITROS.

ERLENMEYER DE BOCA ESTRECHA, DE 100 MILILITROS.

2.2.3 REACTIVOS:

SOLUCION DE METILATO DE SODIO OBTENIDA DISOLVIENDO 1 GRAMO DE SODIO EN 100 MILILITROS DE METANOL QUE NO CONTENGA MAS DEL 0,5 POR 100 (M/M) DE AGUA.

SOLUCION METANOLICA DE ACIDO CLORHIDRICO DE ALREDEDOR DE 1 N (VER OBSERVACIONES 2.2.6, A) Y B).

HEPTANO PARA CROMATOGRAFIA (NOTA 2, NOTA 4).

SULFATO DE SODIO ANHIDRO.

NITRATO QUE CONTENGA MENOS DE 5 MILIGRAMOS DE OXIGENO POR KILOGRAMO.

2.2.4 METODO OPERATORIO PARA LOS CUERPOS GRASOS ACIDOS (IA > 2):

EN PRESENCIA DE ACEITES QUE CONTENGAN ACIDOS DE MAS DE 2 DOBLES ENLACES ES RECOMENDABLE ELIMINAR EL AIRE CONTENIDO EN EL METANOL Y EN EL MATRAZ MEDIANTE BURBUJEO DE NITROGENO DURANTE ALGUNOS MINUTOS.

EN UN ERLENMEYER O UN MATRAZ DE 250 MILILITROS INTRODUCIR ALREDEDOR DE 4 GRAMOS (NOTA 5) DE CUERPO GRASO PREPARADO.

AÑADIR 40 MILILITROS DE LA SOLUCION DE METILATO DE SODIO (VER OBSERVACION 2.2.6, C). PONER BAJO REFRIGERANTE A REFLUJO, AGITAR Y LLEVAR A EBULLICION. LA SOLUCION DEBE HACERSE LIMPIDA, LO QUE SE PRODUCE GENERALMENTE AL CABO DE UNA DECENA DE MINUTOS. LA REACCION ESTARA PRACTICAMENTE FINALIZADA DESPUES DE QUINCE MINUTOS.

INTRODUCIR A CONTINUACION EN EL ERLENMEYER O EN EL MATRAZ AL MENOS 50 MILILITROS DE LA SOLUCION CLORHIDRICA, LUEGO LLEVARLA DE NUEVO A EBULLICION DURANTE DIEZ MINUTOS (VER OBSERVACION 2.2.6, D).

REFRIGERAR BAJO CORRIENTE DE AGUA, AÑADIR A CONTINUACION EN EL ERLENMEYER O EN EL MATRAZ 100 MILILITROS DE AGUA, VERTER LUEGO LA MEZCLA EN UNA AMPOLLA DE DECANTACION DE 250 MILILITROS Y AÑADIR 30 MILILITROS DE HEPTANO (VER NOTA 4). AGITARLA VIGOROSAMENTE Y DEJARLA DECANTAR HASTA UNA SEPARACION COMPLETA DE LAS DOS FASES. RECOGER LA FASE HEPTANICA. EXTRAER LA FASE ACUOSA UNA SEGUNDA VEZ MEDIANTE 30 MILILITROS DE HEPTANO. REUNIR LOS DOS EXTRACTOS HEPTANICOS Y LAVARLOS VARIAS VECES CON AGUA HASTA LA NEUTRALIDAD. DESPUES DE LA DECANTACION, SECAR SOBRE SULFATO DE SODIO. FILTRAR SOBRE ALGODON Y EVAPORAR EL DISOLVENTE, SI FUERA NECESARIO, HASTA 20 MILILITROS EN BAÑO DE AGUA HIRVIENDO BURBUJEANDO NITROGENO EN UN ERLENMEYER DE 100 MILILITROS (NOTA 6, NOTA 7).

2.2.5 METODO OPERATORIO PARA LOS ACIDOS GRASOS:

PARA LOS ACIDOS GRASOS SERA CONVENIENTE UTILIZAR EL METODO OPERATORIO SIMPLIFICADO SIGUIENTE:

EN PRESENCIA DE ACIDOS GRASOS QUE CONTENGAN ACIDOS DE MAS DE 2 DOBLES ENLACES ES RECOMENDABLE ELIMINAR EL AIRE CONTENIDO EN EL METANOL Y EN EL MATRAZ BURBUJEANDO NITROGENO DURANTE ALGUNOS MINUTOS. EN UN ERLENMEYER O UN MATRAZ DE 250 MILILITROS, INTRODUCIR ALREDEDOR DE 4 GRAMOS (NOTA 5) DE CUERPO GRASO PREPARADO.

INTRODUCIR 50 MILILITROS DE LA SOLUCION CLORHIDRICA Y UN REGULADOR DE EBULLICION, ADAPTAR EL REFRIGERANTE, DESPUES LLEVAR A EBULLICION DURANTE DIEZ MINUTOS.

REFRIGERAR BAJO CORRIENTE DE AGUA, AÑADIR A CONTINUACION EN EL ERLENMEYER O EN EL MATRAZ 100 MILILITROS DE AGUA, LUEGO VERTER LA MEZCLA EN UNA AMPOLLA DE DECANTACION DE 250 MILILITROS Y AÑADIR 30 MILILITROS DE HEPTANO (NOTA 4). AGITAR VIGOROSAMENTE Y DEJARLA DECANTAR HASTA UNA SEPARACION COMPLETA DE LAS DOS FASES. DECANTAR LA FASE ACUOSA Y EXTRAERLA UNA SEGUNDA VEZ MEDIANTE 30 MILILITROS DE HEPTANO. REUNIR LOS DOS EXTRACTOS HEPTANICOS Y LAVARLOS VARIAS VECES CON AGUA HASTA LA NEUTRALIDAD. DESPUES DE LA DECANTACION, SECAR SOBRE SULFATO DE SODIO. FILTRAR SOBRE ALGODON Y EVAPORAR HASTA 20 MILILITROS EL DISOLVENTE EN BAÑO DE AGUA HIRVIENDO BURBUJEANDO NITROGENO EN UN ERLENMEYER DE 100 MILILITROS (NOTA 6, NOTA 7).

2.2.6 OBSERVACIONES:

A) EN EL LABORATORIO ES FACIL PREPARAR PEQUEÑAS CANTIDADES DE ACIDO CLORHIDRICO GASEOSO ANHIDRO POR SIMPLE DESPLAZAMIENTO DE SU SOLUCION COMERCIAL (D = 1,18), AÑADIENDOLE POCO A POCO ACIDO SULFURICO CONCENTRADO (D = 1,84). EL GAS QUE SE DESPRENDA SERA SIMPLEMENTE SECADO MEDIANTE BURBUJEO EN EL ACIDO SULFURICO.

AL SER EL METANOL MUY AVIDO DE GAS CLORHIDRICO, SERA RECOMENDABLE TOMAR TODAS LAS PRECAUCIONES DE UTILIZACION PARA LA DISOLUCION, POR EJEMPLO: EFECTUAR LA INTRODUCCION DEL GAS CON LA AYUDA DE UN PEQUEÑO EMBUDO INVERTIDO QUE LLEGUE HASTA LA SUPERFICIE DEL NIVEL DEL METANOL. ES POSIBLE, ADEMAS PREPARAR DE ANTEMANO CANTIDADES IMPORTANTES DE SOLUCIONES METANOLICAS CLORHIDRICAS QUE SE CONSERVAN PERFECTAMENTE EN FRASCOS ESMERILADOS MANTENIDOS EN LA OSCURIDAD.

B) ES POSIBLE UTILIZAR ACIDO SULFURICO METANOLICO DE ALREDEDOR DE 1 N EN LUGAR DE ACIDO CLORHIDRICO METANOLICO, PERO LA DURACION DE LA ESTERIFICACION DEBERA SER DE VEINTE MINUTOS, COMO MINIMO, Y LOS PRECIPITADOS DE SULFATO DE SODIO ENTORPECEN LA EBULLICION E IMPONEN LA FILTRACION O EL EMPLEO DE UN AGITADOR MAGNETICO.

C) ANTES DE LA INTRODUCCION DE LA MUESTRA, TAMBIEN ES POSIBLE VERTER 40 MILILITROS DE METANOL Y AÑADIR 0,4 GRAMOS DE SODIO, LO QUE SUPONE UNA SOLUCION DE METILATO DE SODIO PREPARADA Y ADMINISTRADA AL MOMENTO,

D) EN CASO DE MATERIAS GRASAS MUY ACIDAS, SE PRODUCE, HABIDA CUENTA DE LA CANTIDAD RELATIVAMENTE IMPORTANTE DE METILATO DE SODIO, UNA PRECIPITACION DE CLORURO DE SODIO QUE PUEDE PROVOCAR ALGUNOS SOBRESALTOS EN EL CURSO DE LA EBULLICION QUE SIGUE. ES POSIBLE FILTRAR DICHO PRECITADO, PERO ELLO NO ES NECESARIO GENERALMENTE DEBIDO A LA BREVE DURACION DEL CALENTAMIENTO PRECONIZADO.

NOTAS:

1. SI ENTORPECIERA EL INSAPONIFICABLE, SE DILUIRA CON AGUA LA SOLUCION OBTENIDA DESPUES DE LA SAPONIFICACION Y SE ELIMINARA EL INSAPONIFICABLE MEDIANTE EXTRACCION POR OXIDO DIETILICO, HEXANO O ETER DE PETROLEO EN LAS CONDICIONES ACOSTUMBRADAS.

ACIDIFICAR LA SOLUCION JABONOSA ACUOSA, Y SEPARAR LOS ACIDOS GRASOS.

PREPARAR SUS ESTERES METILICOS SEGUN LOS PROCEDIMIENTOS 1.4.2 O 2.3.5.

2.

DURANTE LA CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA DE LOS ESTERES METILICOS, ALGUNOS REACTIVOS Y EN ESPECIAL LAS SOLUCIONES METANOLICAS DE TRIFLUORURO DE BORO PUEDEN LLEVAR A LA APARICION DE PICOS PARASITOS (EN LA REGION ( 20 C 22 PARA LAS SOLUCIONES METANOLICAS DE TRIFLUORURO BORO). COMO CONSECUENCIA, CADA NUEVO LOTE DE REACTIVO DEBERA SOMETERSE A PRUEBA PREPARANDO ESTERES METILICOS DEL ACIDO OLEICO PURO Y DESPUES CROMATROGRAFIANDOLES. SI APARECIERA UN PICO PARASITO DEBERA ELIMINARSE EL REACTIVO UTILIZADO.

LOS DISTINTOS REACTIVOS NO DEBEN DAR EL PICO QUE INTERFIERA CON LOS DE LOS ESTERES METILICOS DE ACIDOS GRASOS EN EL CURSO DE LA CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA.

3. SI FUERA ABSOLUTAMENTE INDISPENSABLE PREPARAR UNA SOLUCION METANOLICA DE TRIFLUORURO DE BORO, A PARTIR DE TRIFLUORURO DE BORO GASEOSO, OPERAR COMO SIGUE:

TARAR UN MATRAZ DE DOS LITROS QUE CONTENGA UN LITRO DE METANOL.

ENFRIAR EN UN BAÑO DE AGUA HELADA. ESTANDO TODAVIA EL MATRAZ EN EL BAÑO, BURBUJEAR CON BF 3 PROCEDENTE DE UNA BOTELLA DE GAS POR MEDIO DE UN TUBO DE VIDRIO EN EL METANOL HASTA LA ABSORCION DE 125 GRAMOS, OPERANDO BAJO UNA CAMPANA DE GASES. HACER PASAR LA CORRIENTE DE BF 3 AL TUBO DE VIDRIO ANTES DE SUMERGIRLO EN EL METANOL Y HASTA QUE SEA RETIRADO PARA EVITAR CUALQUIER VUELTA DE LIQUIDO AL SISTEMA DESCOMPRESOR DE GAS. EL GAS, AL ESCAPARSE DEMASIADO RAPIDAMENTE, NO DEBERIA DAR COMO RESULTADO PEQUEÑAS NUBES DE HUMO BLANCO. EL REACTIVO PERMANECE ESTABLE DURANTE DOS AÑOS.

4. EL HEPTANO (MEZCLA DE ISOMEROS C 7 PUROS SOMETIDA A PRUEBA POR CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA) PUEDE SUSTITUIRSE POR HEXANO EN AUSENCIA DE ACIDOS GRASOS DE 20 ATOMOS DE CARBONO Y MAS.

5. SI NO SE DISPUSIERA DEL PESO DE MUESTRA PREVISTA, ESTA PODRA SER REDUCIDA HASTA 10 MILIGRAMOS E INCLUSO HASTA MENOS, SIEMPRE QUE DISMINUYAN PROPORCIONALMENTE LOS VOLUMENES DE REACTIVOS Y LA CAPACIDAD DEL EQUIPO.

6. LOS ESTERES METILICOS DEBERAN SER ANALIZADOS PREFERENTEMENTE LO MAS RAPIDAMENTE POSIBLE. SI FUERA NECESARIO, LA SOLUCION HEPTANICA QUE CONTENGA LOS ESTERES METILICOS PODRA CONSERVARSE BAJO GAS INERTE Y EN EL REFRIGERADOR. PARA UN ALMANECAMIENTO DE LARGA DURACION SERA DESEABLE PROTEGER LOS ESTERES METILICOS CONTRA LA AUTOOXIDACION POR ADICION A LA SOLUCION DE UN ANTIOXIDANTE EN UNA CONCENTRACION QUE NO INTERFIERA EN LOS ANALISIS ULTERIORES, POR EJEMPLO, UN 0,005 POR 100 (M/V) DE BHT (DIETIBUTIL-2-6-METIL-4 FENOL). SI FUERA NECESARIO, LOS ESTERES METILICOS SECOS Y SIN DISOLVENTE PODRAN, EN SU CASO, CONSERVARSE VEINTICUATRO HORAS BAJO GAS INERTE EN EL REFRIGERADOR, O MAS TIEMPO, EN TUBO SELLADO EN VACIO EN EL CONGELADOR.

7. EXISTE UN RIESGO DE PERDER UNA PARTE DE LOS ESTERES METILICOS MAS VOLATILES SI LA ELIMINACION DEL DISOLVENTE SE PROLONGA O SI LA CORRIENTE DE NITROGENO FUERA DEMASIADO VIGOROSA.

PARA LA ESPECTROFOTOMETRIA INFRARROJA DICHA ELIMINACION DEL DISOLVENTE DEBERA SER LO MAS COMPLETA POSIBLE. PARA LA CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA ES DESEABLE NO

EXPULSAR EL DISOLVENTE.