Agencia Estatal Boletín Oficial del Estado
El Consorcio Centro de Investigación Biomédica en Red, M.P., es un consorcio público de los previstos en los artículos 118 a 127 de la Ley 40/2015, de 1 de octubre, de Régimen Jurídico del Sector Público, dotado de personalidad jurídica propia y adscrito al Instituto de Salud Carlos III.
El Consorcio Centro de Investigación Biomédica en Red, M.P., y la Fundació Institut d’Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol (IGTP) han suscrito con fecha 14 de diciembre de 2018 un convenio.
En cumplimiento de lo dispuesto en el artículo 48.8 de la Ley 40/2015, de 1 de octubre, de Régimen Jurídico del Sector Público, se dispone su publicación en el «Boletín Oficial del Estado».
Madrid, 7 de febrero de 2019.–La Presidenta del Consejo Rector del Consorcio Centro de Investigación Biomédica en Red, M.P., Raquel Yotti Álvarez.
En Madrid, a 14 de diciembre 2018.
INTERVIENEN
De una parte, el Consorcio Centro de Investigación Biomédica en Red, M.P., con domicilio en c/ Monforte de Lemos número 5, 28029 de Madrid y CIF G85296226, representado por don Manuel Sánchez Delgado, gerente del mismo y en virtud de las facultades que le confiere el poder notarial otorgado ante el notario de Madrid, don Joaquín Corell Corell, el día 15 de noviembre de 2012, con número tres mil seiscientos noventa y ocho de su protocolo (en adelante, CIBER).
De otra parte, Fundació Institut d’Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol, representada en este acto por don Manel Puig Domingo, en calidad de director y con domicilio en Crta. Canyet, s/n 08916 Badalona, y en virtud de las facultades que le confiere por poder otorgado ante el notario de Barcelona D. Francisco Armas Omedes, de fecha 29 de julio de 2016, escriturado con el n.º 2233 de su protocolo (en adelante, IGTP).
Las partes se reconocen recíprocamente la capacidad para la firma de este Protocolo y, por este motivo,
EXPONEN
I. Ámbito Normativo
I. Que corresponde a la Administración General del Estado en virtud de lo establecido en el artículo 149.1.15 de la Constitución, la competencia exclusiva sobre el fomento y coordinación general de la investigación científica y técnica.
II. La Ley 14/2007, de 3 de julio, de Investigación biomédica, por la que se regula la investigación biomédica, contempla el fomento y la promoción de la actividad investigadora en el Sistema Nacional de Salud y prevé la colaboración y participación para la ejecución de programas o proyectos de investigación.
III. El artículo 47 de la Ley 40/2015, de 1 de octubre, de Régimen Jurídico del Sector Público, define los convenios como aquellos acuerdos con efectos jurídicos adoptados por las Administraciones Públicas, los organismos públicos y entidades de derecho público vinculados o dependientes o las Universidades públicas entre sí.
IV. Que de acuerdo con la Orden Ministerial SCO/806/2006 de 13 de marzo, por la que se aprueban las bases reguladoras para la concesión de ayudas destinadas a financiar estructuras estables de investigación cooperativa, en el área de biomedicina y ciencias de la salud, establece que los CIBER tienen como objeto:
a) Impulsar la investigación de excelencia en Biomedicina y Ciencias de la Salud que se realiza en el Sistema Nacional de Ciencia y Tecnología, mediante el desarrollo y potenciación de estructuras estables de Investigación Cooperativa.
b) Promover y financiar, a través del Instituto de Salud Carlos III, O.A, M.P., la asociación estable de grupos de investigación pertenecientes a centros de investigación, en las diversas modalidades de Investigación Cooperativa en Red (Centro de Investigación Biomédica en Red y Redes Temáticas de Investigación Cooperativa en Salud), para contribuir a fundamentar científicamente los programas y políticas del Sistema Nacional de Salud en las áreas prioritarias del Plan Nacional de I+D+I.
c) Generar grandes Centros de Investigación traslacional estables, de carácter multidisciplinar y pluriinstitucional, donde se integre la investigación básica, clínica y poblacional, al objeto de desarrollar un único programa común de investigación, focalizado en ciertas patologías que son relevantes para el Sistema Nacional de Salud por su prevalencia o que, debido a la repercusión social de las mismas, son consideradas estratégicas para el mismo.
II. Fines de las Instituciones
I. Que IGTP es una fundación del sector público cuyos fines son la producción del conocimiento de excelencia para la mejora de la salud mediante el desarrollo de proyectos de investigación, la formación de investigadores y la transferencia de tecnología, tratando que sea un beneficio para la salud y el bienestar de la población.
II. Que el CIBER es un Consorcio constituido por diversas instituciones y centros de investigación con sede social en distintas Comunidades Autónomas, el CSIC, M.P. y el Instituto de Salud Carlos III,O.A,M.P. el cual, de conformidad con el artículo 2 de sus estatutos, es uno de los instrumentos de los que dispone la Administración para alcanzar las metas establecidas en la Estrategia Estatal y en el Plan Estatal de Investigación Científica y Técnica y de Innovación para el periodo 2013-2020, así como contempla que son finalidades específicas del Consorcio las siguientes:
a) La realización de programas conjuntos de investigación, desarrollo e innovación en las áreas temáticas de Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina, Enfermedades Raras, Enfermedades Respiratorias, Enfermedades Hepáticas y Digestivas, Epidemiología y Salud Pública, Salud Mental, Diabetes y Enfermedades Metabólicas y Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición, Fragilidad y Envejecimiento Saludable, Enfermedades Cardiovasculares y Cáncer.
b) Contribuir a la resolución de los problemas de la asistencia sanitaria relacionados con dichas áreas.
c) Promover la participación en actividades de investigación de carácter nacional y especialmente de las incluidas en los Programas Marco Europeos de I+D+I y en Horizonte 2020.
d) Promover la transferencia y la explotación económica de resultados de los procesos de investigación hacia la sociedad y en especial al sector productivo para incrementar su competitividad.
e) Promover la difusión de sus actividades y la formación de investigadores competitivos en el ámbito de cada área temática de investigación.
III. Declaración de intenciones
Con base en los fines antes expuestos, es objetivo común a las partes impulsar la investigación y están de acuerdo, en la necesidad de colaborar de forma que se impulse y posibilite la participación de los profesionales sanitarios en los grupos de investigación, concretamente, en el área temática de enfermedades hepáticas y digestivas, por lo que, deciden formalizar el presente Convenio que se regirá por las siguientes
CLÁUSULAS
IGTP y el CIBER tienen como finalidad común la promoción de la Investigación Biomédica y más concretamente incentivar e incrementar la Investigación en sus centros asistenciales. De acuerdo con esta idea IGTP y el CIBER asignarán recursos y coordinarán la labor investigadora en sus centros asistenciales.
En este sentido, ambas partes impulsarán la investigación a través de la coordinación de sus estructuras, de sus conocimientos y de sus disponibilidades, impulsando la participación de los profesionales en la investigación en el área temática de enfermedades hepáticas y digestivas.
El Convenio se concreta en la colaboración conjunta a través de una línea de investigación mediante la aportación de IGTP de fondos al CIBER para la realización de los proyectos de Investigación que se adjuntan en el Anexo del presente Convenio.
a) Las aportaciones económicas que se efectúen por parte de IGTP al CIBER se destinarán exclusivamente a la realización de los proyectos de investigación que se adjuntan en el anexo del presente Convenio.
b) La colaboración en los Proyectos de Investigación: Proyecto n.º 1 «Desarrollo de plataformas bioactivas para el tratamiento endoscópico del cáncer de colon y recto y Proyecto n.º 2 «Evaluación del funcionalismo de monocitos y macrófagos del sistema GALT en la Insuficiencia hepática crónica agudizada. Posibles estrategias terapéuticas. Estudio clínico y experimental» se traducirá en la financiación de una cuantía total de treinta y cinco mil cuatrocientos euros (35.400 €) que se repartirán al 50% para cada uno de los dos proyectos.
Del mismo modo, El CIBER aporta el uso de los medios técnicos e infraestructuras científicas para los proyectos de Investigación, en concreto en el proyecto 1 efectuará la colaboración en el desarrollo de plataformas biodegradables mediante las tareas descritas en el anexo I, y en el proyecto 2 efectuará el desarrollo del modelo de insuficiencia hepática agudizada, laparotomía y obtención de muestras, estudio de Translocación Bacteriana, aislamiento de macrófagos de lámina propia, realización de test y estudio histológico de hígado (diagnóstico de cirrosis) y de ciego descritos en el anexo I.
La composición de la Comisión de Seguimiento y Evaluación del Programa será la siguiente:
A) En representación del CIBER:
– El Gerente del CIBER, o persona en quien delegue.
– El responsable de convenios del CIBER, o persona en quien delegue.
– Un Investigador Principal del CIBER o persona en quien delegue.
B) En representación IGTP:
– El Director del IGTP, o persona en quien delegue.
– El responsable de convenios del IGTP, o persona en quien delegue.
– Un Investigador Principal del IGTP o persona en quien delegue.
El funcionamiento de este órgano paritario y colegiado se adecuará a lo indicado en los artículos 15 a 22 de la Ley 40/2015, de 1 de octubre, de Régimen Jurídico del Sector Público.
La cantidad que IGTP transferirá al CIBER es por un importe de treinta y cinco mil cuatrocientos euros (35.400 €).
Dicha cuantía no incluye IVA pues las cantidades a aportar por IGTP no lo son en concepto de contraprestación directa y equivalente a los servicios a prestar por el CIBER, sino que tienen como finalidad coadyuvar a la consecución del objeto común y a los fines del presente Convenio establecidos en las cláusulas primera y segunda.
IGTP ingresará dicha cantidad en la cuenta corriente del Banco Sabadell titularidad de CIBER cuyo código IBAN es: ES23 0081 0398 8600 0182 8991.
El CIBER aporta el uso de los medios técnicos e infraestructuras científicas para los proyectos de Investigación, en concreto en el proyecto 1 efectuará la colaboración en el desarrollo de plataformas biodegradables mediante las tareas descritas en el anexo I, y en el proyecto 2 efectuará el desarrollo del modelo de insuficiencia hepática agudizada, laparotomía y obtención de muestras, estudio de Translocación Bacteriana, aislamiento de macrófagos de lámina propia, realización de test y estudio histológico de hígado (diagnostico de cirrosis) y de ciego descritos en el anexo I.
1. La Comisión de Seguimiento y Evaluación cuya composición se establece en la cláusula cuarta de este Convenio será la encargada de velar por su cumplimiento y desarrollo.
2. IGTP efectuará la transferencia de la cantidad fijada en la adenda al CIBER, a partir de la fecha en que surta efectos el presente Convenio.
3. El CIBER presentará antes del 31 de marzo del ejercicio presupuestario inmediatamente posterior, una certificación conforme la transferencia ha sido destinada a la financiación de los objetivos del Programa, detallados en la cláusula segunda de este Convenio.
4. El CIBER deberá comprobar las justificaciones que correspondan a las Instituciones beneficiarias de las ayudas del Programa, y cuando proceda ponerlas a disposición de IGTP, y de los respectivos órganos de fiscalización y control de cuentas, según lo establecido en la Ley 47/2003, de 26 de noviembre, General Presupuestaria.
5. El CIBER se compromete a respetar la normativa vigente y a cumplir con las obligaciones que le imponen las disposiciones aplicables a la realización del Proyecto científico comprendiendo la cumplimentación de cualquier notificación y/o comunicación preceptiva y obtención de cualquier autorización que deba recabarse, ya sea de las autoridades sanitarias o de los responsables de los centros sanitarios. Si así se fija en el proyecto, será imprescindible la firma del Consentimiento Informado previo de cada paciente.
6. El presente Convenio no instrumenta la concesión de una subvención, de conformidad con la Ley 38/2003, de 17 de noviembre, General de Subvenciones.
Las publicaciones que se deriven del desarrollo de éste Convenio deben explicitar el origen de la financiación. La utilización y difusión de otros resultados de la investigación diferentes a las publicaciones científicas se hará de común acuerdo entre las partes.
Los derechos de propiedad intelectual que puedan resultar del desarrollo del proyecto que constituye el objeto del presente Convenio se repartirán entre las partes en la siguiente proporción: IGTP 36%, CIBER 64%.
La colaboración no implica relación laboral alguna con cualquiera de las partes que firman este Convenio, y se basa en los principios de buena fe y de eficacia para que la labor investigadora pueda ser realizada con éxito.
El presente Convenio resultará eficaz una vez inscrito en el Registro Electrónico estatal de Órganos e Instrumentos de Cooperación del sector público estatal, y publicado en el «Boletín Oficial del Estado» y tendrá una eficacia de un año, pudiendo prorrogarse anualmente de forma expresa por las partes antes del vencimiento de su vigencia inicial o, en su caso, de sus prórrogas, hasta un máximo de cuatro prórrogas de conformidad con lo dispuesto en el artículo 49 h) de la Ley 40/2015, de 1 de octubre, de Régimen Jurídico del Sector Público.
En el caso de que por mutuo acuerdo se decida la prórroga, dicha decisión deberá contar previamente con un informe en el que se ponga de manifiesto los beneficios de dicha prórroga en relación con el desarrollo del proyecto.
Las partes firmantes podrán modificar los términos del presente Convenio en cualquier momento, mediante acuerdo unánime de todos ellos, que se reflejará en una adenda al mismo.
El presente Convenio se regulará por mutuo acuerdo entre las partes. Las dudas y controversias que surjan con motivo de la interpretación y aplicación del mismo que no puedan ser resueltas de forma amigable, se resolverán de conformidad con las normas reconocidas por el Derecho y ante la Jurisdicción Contenciosa Administrativa.
El presente Convenio se rige por lo dispuesto en el capítulo VI del título preliminar de la Ley 40/2015, de 1 de octubre, de Régimen Jurídico del Sector Público.
Las partes se comprometen a tratar los datos de carácter personal a que, en su caso, tengan acceso o sean objeto de cesión en el marco de aplicación del presente Convenio, de conformidad con lo que dispone el Reglamento (UE) 2016/679 del Parlamento Europeo y del Consejo de 27 de abril de 2016 relativo a la protección de las personas físicas en lo que respecta al tratamiento de datos personales y a la libre circulación de estos datos (Reglamento general de protección de datos).
El presente Convenio se extingue por el cumplimiento de las actuaciones que constituyen su objeto o por incurrir en causa de resolución.
Son causas de resolución del presente Convenio:
– El acuerdo unánime de todos los firmantes.
– Extinción por expiración del plazo de eficacia inicial o, en su caso, de cualquiera de sus prorrogas.
– El incumplimiento de las obligaciones y compromisos asumidos por parte de alguno de los firmantes. En este caso, cualquiera de las partes podrá notificar a la parte incumplidora un requerimiento para que cumpla en un determinado plazo con las obligaciones o compromisos que se consideran incumplidos. Este requerimiento será comunicado al responsable del mecanismo de seguimiento, vigilancia y control de la ejecución del Convenio y a las demás partes firmantes. Si trascurrido el plazo indicado en el requerimiento persistiera el incumplimiento, la parte que lo dirigió notificará a las partes firmantes la concurrencia de causa de resolución y se entenderá resuelto el Convenio.
La resolución del Convenio por esta causa podrá conllevar la indemnización de los perjuicios causados, de acuerdo con los criterios que se determinen por la comisión de seguimiento.
– Extinción por denuncia unilateral de cualquiera de las partes, para lo cual es suficiente un preaviso de tres meses.
– Por decisión judicial declaratoria de la nulidad del Convenio.
Y en prueba de conformidad, firman por duplicado el presente ejemplar y a un solo efecto, en la ciudad y fecha al comienzo expresadas.–El Gerente del Consorcio, Manuel Sánchez Delgado.–El Director del IGTP, Manel Puig Domingo.
PROYECTO 1
Desarrollo de plataformas bioactivas para el tratamiento endoscópico del cáncer de colon y recto
El cáncer de colon y recto (CCR) es el tercer cáncer más frecuente en los hombres, y el segundo en las mujeres. La endoscopia digestiva es la prueba diagnóstica de referencia en el CCR. Por otra parte, su uso como herramienta terapéutica se ha incrementado en los últimos años como consecuencia del gran avance en las técnicas de resección endoscópica. La vertiente terapéutica de la endoscopia digestiva en el CCR se fundamenta en la prevención de la recurrencia tras la resección que a pesar de ello puede llegar a tener un riesgo de recurrencia del 20% en casos de carcinoma invasor. A raíz de estas evidencias cobra una especial importancia el poder disponer de un apósito de colon, específicamente diseñado, que favorezca por una parte una reepitelización fisiológica de la mucosa y por otra la liberación de principios activos que permita tratar directamente las lesiones mucosas. Estos apósitos nos servirían para prevenir las complicaciones derivadas de la escara colónica y tratar lesiones tumorales, ya que se pueden aplicar directamente sobre la mucosa a través del canal de trabajo del endoscopio.
Objetivo:
Con el presente proyecto se desarrollarán plataformas biodegradables fáciles de administrar con el endoscopio con capacidad de incorporar fármacos antitumorales de última generación, para valorar prevención de la recurrencia del CCR postresección, mediante la aplicación de estos hidrogeles bioactivos en la escara tras la resección endoscópica de tumores de colon inducidos en un modelo experimental de CCR por azoximetano en ratas.
Tareas a realizar por CIBER:
1. Se utilizará como sustrato el hidrogel desarrollado y patentado por nuestro grupo (apósito Tri-Bio), que permite la liberación local y selectiva de fármacos antitumorales (irinotecán) y/o antiangiogénicos (bevacizumab y cetuximab). Este hidrogel basado en la mezcla de ácido hialurónico y otros componentes tiene una viscosidad i adherencia a la mucosa intestinal óptimas para ser administrado mediante el canal de trabajo del endoscopio (2,5-3 mm diámetro). El compuesto es líquido a temperatura ambiente y gelifica y se adhiere a temperatura corporal. Además tiene una estructura en malla capaz de encapsular y liberar de forma sostenida los distintos fármacos.
2. La inducción de carcinogénesis colónica se realizará a 56 ratas Sprague-Dawley macho de 100-125g, mediante la administración de 16 mg/Kg de azoximetano s.c. disuelto en suero fisiológico a una concentración de 10 mg/mL, 1 vez por semana durante 2 semanas. Los animales se dejarán con comida y bebida ad libitum.
3. Se realizarán endoscopias de seguimiento cada 4 semanas hasta la aparición de tumores, que se espera aparezcan sobre las 30 semanas. En este momento se realizarán resecciones endoscópicas de las lesiones tumorales presentes en el colon, que se conservarán en formol al 4% para su posterior estudio histológico. Para ello se utilizará un endoscopio de 4,9 mm de diámetro Olympus Lucera 260 -HDTV/NBI/AFI con un un canal de trabajo de 2,8 mm.
Tras lo cual, los animales serán aleatorizados en 7 grupos de tratamiento (n=8), aplicados mediante el canal de trabajo del endoscopio sobre la escara tras la resección endoscópica hasta cubrir toda la zona resecada:
– Grupo 1 (n=8): Se tratarán con el apósito (Tri-Bio) base sin fármaco activo.
– Grupo 2 (n=8): Se tratarán con el apósito (Tri-Bio) base con Irinotecán (1,3 mg/mL de apósito).
– Grupo 3 (n=8): Se tratarán con el apósito (Tri-Bio) base con Irinotecán (1,3 mg/mL de apósito) + Bevacizumab (1.25 mg/mL).
– Grupo 4 (n=8): Se tratarán con el apósito (Tri-Bio) base con Irinotecán (1,3 mg/mL de apósito) + Cetuximab (0.26 mg/mL).
– Grupo 5 (n=8): Se tratarán con el apósito (Tri-Bio) base con Bevacizumab (1.25 mg/mL).
– Grupo 6 (n=8): Se tratarán con el apósito (Tri-Bio) base con Cetuximab (0.26 mg/mL).
– Grupo 7 (n=8): Se tratarán con el apósito (Tri-Bio) base con Bevacizumab (1.25 mg/mL) + Cetuximab (0.26 mg/mL).
4. Tras la administración de los apósitos correspondientes, los animales serán evaluados de forma periódica mediante estudio endoscópico (48h, 7 días y 2 semanas), para la obtención de imágenes.
5. A los 14 días se sacrificarán los animales mediante sobredosis de pentobarbial. Se resecará la totalidad del colon, se evaluará su aspecto macroscópico e histológico de las áreas con resección tumoral. El análisis histológico se centrará en la eficacia terapéutica de este apósito en este modelo. Así mismo se recogerá plasma para estudio de marcadores tumorales.
PROYECTO 2
Evaluación del funcionalismo de monocitos y macrófagos del sistema GALT en la Insuficiencia hepática crónica agudizada. Posibles estrategias terapéuticas. Estudio clínico y experimental
En la historia natural de la cirrosis, clásicamente se han diferenciado dos fases, una primera compensada y una segunda descompensada. Esta última representa la primera causa de ingreso hospitalario con un empeoramiento del pronóstico. Dentro de la cirrosis descompensada, recientemente se ha descrito el que se conoce como insuficiencia hepática crónica agudizada (IHCA) que consiste en una agudización de la insuficiencia hepática, secundaria a un factor precipitante ya sea hepático o extrahepático, asociado a un fracaso multiorgánico con una mortalidad elevada. La causa más frecuente de IHCA es la infección bacteriana (33%). No obstante, todavía existen muchos interrogantes sobre la fisiopatología de este síndrome. Se han propuesto tres elementos claves para su desarrollo: la disfunción del sistema inmune local, la translocación bacteriana (TB) y la disfunción circulatoria que presentan los pacientes cirróticos.
En el momento actual no existe un tratamiento específico de la IHCA, basándose únicamente en medidas de soporte así como el tratamiento del factor precipitante si es conocido. Han aparecido algunos estudios sobre el uso de rifaximina para la profilaxis de la peritonitis bacteriana espontanea, aunque con resultados contradictorios. En ese sentido, la rifaximina podría tener un efecto inmunomodulador y de refuerzo sobre la barrera mucosa intestinal del mismo modo que se ha descrito para norfloxacino y otros antibióticos y esto es lo que quiere testar el CIBER.
Existen modelos experimentales de insuficiencia hepática crónica agudizada basados en la administración de tetracloruro de carbono. Con este modelo, las ratas desarrollan una cirrosis micronodular, HTPo, desarrollo de colaterales (30-60%) y circulación hiperdinámica a partir de las 8-15 semanas y la mayoría desarrollará ascitis. La administración de LPS en este momento activa el sistema inmune innato e induce una respuesta de fase aguda que conduce a una situación clínica que imita la IHCA clínica, aunque en estos animales el inicio y la progresión de la sepsis conduce a un fallo multiorgánico en horas a diferencia de lo que ocurre en los pacientes.
Objetivos:
1. Describir la funcionalidad inmune local del sistema GALT y en sangre periférica (fagocitosis y/o killing intracelular) así como los niveles de TB en un modelo de IHCA en ratas cirróticas.
2. Evaluar los efectos inmunomoduladores de la rifaximina en un modelo de IHCA en ratas cirróticas, así como su efecto sobre la supervivencia, la funcionalidad de los macrófagos y TB.
Tareas a realizar por CIBER:
1. Desarrollo del modelo de insuficiencia hepática agudizada:
Se incluirán ratas Sprague-Dawley machos de 100-120 g. La cirrosis hepática se inducirá mediante la administración orogástrica de CCl4 a una dosis inicial de 20 µL una vez por semana cuando los animales hayan alcanzado un peso de 200 g. Las dosis posteriores se ajustarán a los cambios de peso del animal a las 48h de la dosis precedente.
El CCl4 se administrará mediante sonda de metal sin anestesia (sonda metálica curvada 75 mm y punta 2 mm diámetro). En el momento de sospecha de ascitis (aumento del volumen abdominal) se realizará una paracentesis exploradora. Al confirmarse, se aleatorizarán los animales cirróticos en 2 grupos de tratamiento:
2. Grupos de tratamiento:
Grupo A: Cirrosis con ascitis, n = 6.
Grupo B: Cirrosis con ascitis tratadas con rifaximina (50mg / Kg / d 10 días), n = 6.
Grupo C: Sanas, n = 6.
Al final del tratamiento se procederá a la realización de la insuficiencia aguda sobre el hígado cirrótico mediante la inyección de Endotoxina (1 mg LPS/Kg i. p.) a los grupos correspondientes (A, B) y a las 24h se sacrificarán los animales.
La mortalidad en este modelo experimental es de alrededor del 50%, por lo que se incluirán un total de 30 animales (24 a los que se inducirá cirrosis y 6 controles sanos).
3. Laparotomía y obtención de muestras:
Se sacrificarán los animales con pentobarbital (250 mg/Kg) y bajo campana de flujo laminar se procederá a laparotomía media y se obtendrán muestras de: ganglios linfáticos mesentéricos, sangre portal y periférica (cava inferior), hígado, y se resecará el íleon terminal y el ciego.
Se obtendrá suero y plasma a partir de sangre periférica que se almacenará en alícuotas de 1mL a -80.ºC hasta su utilización en los diversos tests de cuantificación de citoquinas y otros parámetros bioquímicos, y sangre portal para determinación de endotoxina (kits comerciales).
4. Estudio de Translocación Bacteriana:
Muestras de ganglios mesentéricos previamente homogeneizadas mediante «potter» 1 mL de sangre portal y periférica serán inoculados en frascos Bact/Alert pediátricos y se cultivarán en placas Agar sangre, MacConkey y CPS para identificación de las especies bacterianas.
5. Aislamiento de macrófagos de lámina propria:
Se extraerán macrófagos de lámina propria de la zona cecal. Se extraerá el ciego y se lavará con PBS. Se cortarán 0,5 gramos de tejido en piezas de unos 0,5 cm. Se procederá a una predigestion para eliminar células epiteliales y a continuación se digerirá el tejido mediante gentlemacs®, se filtrará y lavará la suspensión celular y se hará recuento y viabilidad mediante azul de tripano en cámara de Neubauer ajustando la concentración a 2500-3000 células/µL.
6. Test de fagocitosis:
Se realizará a los macrófagos peritoneales y de lámina propia y en sangre periférica, por citometría de flujo mediante el kit comercial (Phagotest®), modificando las condiciones experimentales adaptándolas a nuestras muestras, como hemos hecho en un estudio anterior (FISPI1100187). Se marcan los macrófagos mediante CD11b-APC, se añaden e coli-FITC y se incuba a 37.ºC. Se lavan y se fijan las células y a continuación se identificarán las células que han captado e coli-FITC (530nm) y la cantidad de bacterias fagocitadas (% e intensidad).
7. Test de «Killing» intracelular:
La capacidad bactericida de los macrófagos y monocitos se cuantificará por citometría como la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en presencia de E. coli fagocitadas. Se marcarán los macrófagos con Cd11b-APC y como susbtrato fluorogénico se utilizará dihidrorodamina (DHR 123) que difunde a los compartimentos intracelulares. Se añade E. coli y se incuba a 37.ºC durante 30 minutos. DHR123 al oxidarse pasa a R123 emitiendo a 534 nm, siendo la intensidad de emisión proporcional a la cantidad de DHR123 oxidado.
8. Estudio histológico de hígado (diagnóstico de cirrosis) y de ciego:
Se recogerán las muestras en formol al 4% y serán procesadas de forma habitual. Se valorará la presencia de infiltrado inflamatorio, edema y linfangiectasias.
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