DOUE-L-2016-80401
Europeo
Unión Europea
Reglamento
20151207
266/2016

Reglamento (UE) 2016/266 de la Comisión, de 7 de diciembre de 2015, que modifica, con vistas a su adaptación al progreso técnico, el Reglamento (CE) nº 440/2008, por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) nº 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH).
Diario Oficial de la Unión Europea
20160301
54
L
1
446
/doue/2016/054/L00001-00446.pdf
L
20160304
N
N
N
L
https://data.europa.eu/eli/reg/2016/266/spa
Análisis
Animales
Investigación científica
Laboratorios
Productos químicos
Reglamentaciones técnicas
Sustancias peligrosas
MODIFICA
el anexo del Reglamento 440/2008, de 30 de mayo
Ganadería y animales
Industria
Tecnología e investigación
Unión Europea
LA COMISIÓN EUROPEA,
Visto el Tratado de Funcionamiento de la Unión Europea,
Visto el Reglamento (CE) n.o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 18 de diciembre de 2006, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH), por el que se crea la Agencia Europea de Sustancias y Mezclas Químicas, se modifica la Directiva 1999/45/CE y se derogan el Reglamento (CEE) n.o 793/93 del Consejo y el Reglamento (CE) n.o 1488/94 de la Comisión, así como la Directiva 76/769/CEE del Consejo y las Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE y 2000/21/CE de la Comisión (1), y, en particular, su artículo 13, apartado 2,
Considerando lo siguiente:
(1)
El Reglamento (CE) n.o 440/2008 de la Comisión (2) incluye los métodos de ensayo para la determinación de las propiedades fisicoquímicas, toxicológicas y ecotoxicológicas de las sustancias, que deben aplicarse a efectos del Reglamento (CE) n.o 1907/2006.
(2)
Es necesario actualizar el Reglamento (CE) n.o 440/2008 a fin de incluir métodos de ensayo nuevos y actualizados que han sido adoptados recientemente por la OCDE con el fin de tener en cuenta el progreso técnico, y de garantizar la reducción del número de animales utilizados en los experimentos, de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo (3). Se ha consultado a los interesados sobre el presente proyecto.
(3)
La adaptación contiene veinte métodos de ensayo: un nuevo método para la determinación de una de las propiedades fisicoquímicas, once métodos de ensayo nuevos y tres métodos de ensayo actualizados para la evaluación de la ecotoxicidad, y cinco métodos de ensayo nuevos para evaluar el destino y el comportamiento en el medio ambiente.
(4)
Por tanto, procede modificar el Reglamento (CE) n.o 440/2008 en consecuencia.
(5)
Las medidas previstas en el presente Reglamento se ajustan al dictamen del Comité establecido en virtud del artículo 133 del Reglamento (CE) n.o 1907/2006.
HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:
Artículo 1
El anexo del Reglamento (CE) n.o 440/2008 queda modificado de conformidad con el anexo del presente Reglamento.
Artículo 2
El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de la Unión Europea.
El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.
Hecho en Bruselas, el 7 de diciembre de 2015.
Por la Comisión
El Presidente
Jean-Claude JUNCKER
___________________
(1) DO L 396 de 30.12.2006, p. 1.
(2) Reglamento (CE) n.o 440/2008 de la Comisión, de 30 de mayo de 2008, por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) n.o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH) (DO L 142 de 31.5.2008, p. 1).
(3) Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010 relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (DO L 276 de 20.10.2010, p. 33).
ANEXO
.
El anexo del Reglamento (CE) n.o 440/2008 queda modificado como sigue:
1)Se añade una nota al principio del anexo, antes de la parte A:
«Nota:
Antes de utilizar cualquiera de los siguientes métodos de ensayo con una sustancia de componentes múltiples (MCS), con una sustancia de composición desconocida o variable, producto complejo de reacción o material biológico (UVCB), o con una mezcla, y en caso de que en el respectivo método de ensayo no se indique la aplicabilidad del mismo para estas MCS, UVCB o mezclas, deberá sopesarse si el método es adecuado para alcanzar el objetivo reglamentario previsto.
Si el método se utiliza para ensayar una MCS, UVCB o una mezcla, debe disponerse de información suficiente sobre su composición, en la medida de lo posible, como, por ejemplo, mediante la identidad química de sus componentes, las cantidades en que están presentes, y las propiedades pertinentes de los componentes.».
2)Se añade el capítulo A.24 siguiente:
« A. 24. COEFICIENTE DE REPARTO (N-OCTANOL/AGUA), MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
INTRODUCCIÓN
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 117 (2004).
1.
El coeficiente de reparto (P) se define como la relación de las concentraciones en equilibrio de una sustancia disuelta en un sistema bifásico consistente en dos disolventes considerablemente inmiscibles. En el caso del n-octanol y del agua:
Formula
Como el coeficiente de reparto es el cociente de dos concentraciones, carece de dimensiones y se indica generalmente en forma de su logaritmo decimal.
2.
El Pow es un parámetro clave en los estudios sobre el destino en el medio ambiente de las sustancias. Se ha comprobado que existe una relación muy significativa entre el Pow de la forma no ionizada de las sustancias y su bioacumulación en los peces. También se ha demostrado que el Pow es un parámetro útil en la predicción de la adsorción al suelo y a los sedimentos, y para establecer relaciones cuantitativas estructura/actividad en una amplia gama de efectos biológicos.
3.
La propuesta original del presente método de ensayo se basaba en un artículo de C.V. Eadsforth y P. Moser (1). El desarrollo del método de ensayo y un ensayo de comparación interlaboratorios de la OCDE fueron coordinados por el Umweltbundesamt de la República Federal de Alemania en 1986 (2).
CONSIDERACIONES INICIALES
4.
Pueden determinarse empíricamente valores de log Pow en el intervalo de – 2 a 4 (a veces, hasta 5 y más) (1) por el método de frasco de agitación (capítulo A.8 del presente anexo, TG 107 de la OCDE). El método de HPLC cubre el log Pow en el intervalo de 0 a 6 (1) (2) (3) (4) (5). Este método puede exigir una estimación del Pow para asignar las sustancias de referencia adecuadas y apoyar las eventuales conclusiones a las que se llegue a partir de los datos generados en el ensayo. Los métodos de cálculo se tratan brevemente en el apéndice del presente método de ensayo. El modo de funcionamiento de la HPLC es isocrático.
5.
Los valores de Pow dependen de las condiciones ambientales, como la temperatura, el pH, la fuerza iónica, etc., y estas deben estar definidas en el experimento para que los datos de Pow se puedan interpretar correctamente. Cuando se trate de sustancias ionizables, puede disponerse de otro método [por ejemplo, el proyecto de directrices de la OCDE sobre un método pH-métrico para sustancias ionizadas (6)], que podría utilizarse como método alternativo. Aunque dicho proyecto de directrices de la OCDE puede ser adecuado para determinar el Pow de esas sustancias ionizables, en algunos casos es más conveniente utilizar el método de HPLC a un pH pertinente para el medio ambiente (véase el punto 9).
PRINCIPIO DEL MÉTODO
6.
La HPLC de fase inversa se realiza en columnas analíticas rellenas de una fase sólida comercial con cadenas hidrocarbonadas largas (C8, C18, por ejemplo) unidas por enlaces químicos a la sílice.
7.
Las sustancias inyectadas en una de estas columnas se reparten entre la fase de disolvente móvil y la fase estacionaria de hidrocarburos, y son transportadas a lo largo de la columna por la fase móvil. Las sustancias se retienen en función de su coeficiente de reparto hidrocarburo-agua, de manera que en primer lugar eluyen las sustancias hidrófilas y en último lugar las sustancias lipófilas. El tiempo de retención se describe mediante el factor de capacidad k, dado por la expresión:
Formula
donde tR es el tiempo de retención de la sustancia problema, y t0 es el tiempo muerto, es decir, el tiempo medio que tarda en atravesar la columna una molécula de disolvente. No es necesario utilizar métodos analíticos cuantitativos, sino solo determinar los tiempos de retención.
8.
El coeficiente de reparto octanol/agua de una sustancia problema puede calcularse mediante la determinación experimental de su factor de capacidad k, que se introduce a continuación en la ecuación siguiente:
Formula
donde
a, b
=
coeficientes de regresión lineal.
La ecuación anterior puede obtenerse por regresión lineal del logaritmo del coeficiente de reparto octanol/agua de sustancias de referencia frente al logaritmo de los factores de capacidad de las sustancias de referencia.
9.
El método de HPLC de fase inversa permite la estimación de coeficientes de reparto en el intervalo de log Pow entre 0 y 6, pero en casos excepcionales puede ampliarse para cubrir el intervalo de log Pow entre 6 y 10. Esto puede requerir que se modifique la fase móvil (3). El método no es aplicable a los ácidos y bases fuertes, a los complejos metálicos, a las sustancias que reaccionen con el eluyente, ni a los agentes tensioactivos. Con las sustancias ionizables pueden realizarse mediciones en su forma no ionizada (ácido libre o base libre) solo utilizando un amortiguador adecuado con un pH por debajo del pKa en caso de un ácido libre, o por encima del pKa si se trata de una base libre. Si se llegara a disponer del método pH-métrico para el ensayo de sustancias ionizables (6), se podría utilizar como método alternativo. Si se determina el valor de log Pow para utilizarlo en la clasificación de los peligros para el medio ambiente o en la evaluación del riesgo para el medio ambiente, el ensayo debe realizarse en el intervalo de pH pertinente para el medio natural, es decir, en el intervalo de pH de 5,0 a 9.
10.
Las impurezas pueden hacer en algunos casos que la interpretación de los resultados sea difícil debido a la incertidumbre en la asignación de los picos. En el caso de mezclas que den lugar a una banda sin resolver, deben indicarse los límites superior e inferior de log Pow, y el porcentaje del área de cada pico de log Pow. En el caso de mezclas que sean un grupo de homólogos, deberá indicarse asimismo la media ponderada de log Pow (7), calculada sobre la base de los valores de los distintos Pow y los valores correspondientes de porcentaje del área (8). En el cálculo deben tomarse en consideración todos los picos a los que corresponda un área superior o igual al 5 % del área total de los picos (9):
Formula
La media ponderada de log Pow solo es válida en caso de sustancias o mezclas (por ejemplo, tall oils) compuestas por homólogos (como, por ejemplo, una serie de alcanos). Las mezclas pueden medirse con resultados significativos, a condición de que el detector analítico utilizado tenga la misma sensibilidad respecto a todas las sustancias de la mezcla y la resolución sea adecuada.
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA
11.
Antes de utilizar el método, deben conocerse la constante de disociación, la fórmula estructural y la solubilidad en la fase móvil. Además, sería útil disponer de información sobre la hidrólisis.
CRITERIOS DE CALIDAD
12.
Para aumentar la confianza de la medida, deben hacerse las determinaciones por duplicado.
—
Repetibilidad: Los valores de log Pow derivados de las mediciones repetidas efectuadas en condiciones idénticas y utilizando el mismo conjunto de sustancias de referencia debe estar dentro de un intervalo de ± 0,1 unidades logarítmicas.
—
Reproducibilidad: Si se repiten las mediciones con un conjunto diferente de sustancias de referencia, los resultados pueden ser diferentes. Típicamente, el coeficiente de correlación R correspondiente a la relación entre log k y log Pow de un conjunto de sustancias problema es de alrededor de 0,9, correspondiente a unos coeficientes de reparto octanol/agua de log Pow ± 0,5 unidades logarítmicas.
13.
El ensayo comparativo interlaboratorios ha mostrado que con el método de HPLC pueden obtenerse valores de log Pow en el margen de ± 0,5 unidades de los valores obtenidos con el método de frasco de agitación (2). Pueden encontrarse otras comparaciones en la bibliografía (4) (5) (10) (11) (12). Las gráficas de correlación basadas en sustancias de referencia relacionadas estructuralmente dan los resultados más exactos (13).
SUSTANCIAS DE REFERENCIA
14.
Con el fin de correlacionar el factor de capacidad k medido de una sustancia con su Pow, tiene que establecerse una curva de calibración utilizando al menos seis puntos (véase el punto 24). La selección de las sustancias de referencia adecuadas depende del criterio del analista. Las sustancias de referencia deben tener normalmente valores de log Pow que rodeen al log Pow de la sustancia problema, es decir, al menos una sustancia de referencia debe tener un Pow superior al de la sustancia problema y otra un Pow inferior al de la sustancia problema. La extrapolación debe utilizarse solo en casos excepcionales. Es preferible que estas sustancias de referencia estén relacionadas estructuralmente con la sustancia problema. Los valores de log Pow de las sustancias de referencia utilizados para la calibración deben basarse en datos experimentales fiables. No obstante, en el caso de sustancias con log Pow elevado (normalmente más de 4) podrán utilizarse valores calculados, a menos que se disponga de datos experimentales fiables. Si se utilizan valores extrapolados, se citará un valor límite.
15.
Se dispone de amplias listas de valores de log Pow de muchos grupos de sustancias (14) (15). Si no se tienen datos sobre los coeficientes de reparto de sustancias relacionadas estructuralmente, puede utilizarse una calibración más general, establecida con otras sustancias de referencia. En el cuadro 1 se recogen sustancias de referencia recomendadas y sus valores de Pow. En el caso de las sustancias ionizables, se dan los valores correspondientes a la forma no ionizada. En el ensayo comparativo interlaboratorios se comprobaron la verosimilitud y la calidad de los valores.
Cuadro 1.
Sustancias de referencias recomendadas
Número CAS
Sustancia de referencia
log Pow
pKa
1
78-93-3
2-Butanona
(metiletilcetona)
0,3
2
1122-54-9
4-Acetilpiridina
0,5
3
62-53-3
Anilina
0,9
4
103-84-4
Acetanilida
1,0
5
100-51-6
Alcohol bencílico
1,1
6
150-76-5
4-Metoxifenol
1,3
pKa = 10,26
7
122-59-8
Ácido fenoxiacético
1,4
pKa = 3,12
8
108-95-2
Fenol
1,5
pKa = 9,92
9
51-28-5
2,4-Dinitrofenol
1,5
pKa = 3,96
10
100-47-0
Benzonitrilo
1,6
11
140-29-4
Fenilacetonitrilo
1,6
12
589-18-4
Alcohol 4-metilbencílico
1,6
13
98-86-2
Acetofenona
1,7
14
88-75-5
2-Nitrofenol
1,8
pKa = 7,17
15
121-92-6
Ácido 3-nitrobenzoico
1,8
pKa = 3,47
16
106-47-8
4-Cloroanilina
1,8
pKa = 4,15
17
98-95-3
Nitrobenceno
1,9
18
104-54-1
Alcohol cinamílico
(alcohol cinámico)
1,9
19
65-85-0
Ácido benzoico
1,9
pKa = 4,19
20
106-44-5
p-Cresol
1,9
pKa = 10,17
21
140-10-3
(trans)
Ácido cinámico
2,1
pKa = 3,89 (cis)
4,44 (trans)
22
100-66-3
Anisol
2,1
23
93-58-3
Benzoato de metilo
2,1
24
71-43-2
Benceno
2,1
25
99-04-7
Ácido 3-metilbenzoico
2,4
pKa = 4,27
26
106-48-9
4-Clorofenol
2,4
pKa = 9,1
27
79-01-6
Tricloroetileno
2,4
28
1912-24-9
Atrazina
2,6
29
93-89-0
Benzoato de etilo
2,6
30
1194-65-6
2,6-Diclorobenzonitrilo
2,6
31
535-80-8
Ácido 3-clorobenzoico
2,7
pKa = 3,82
32
108-88-3
Tolueno
2,7
33
90-15-3
1-Naftol
2,7
pKa = 9,34
34
608-27-5
2,3-Dicloroanilina
2,8
35
108-90-7
Clorobenceno
2,8
36
1746-13-0
Éter de alilo y fenilo
2,9
37
108-86-1
Bromobenceno
3,0
38
100-41-4
Etilbenceno
3,2
39
119-61-9
Benzofenona
3,2
40
92-69-3
4-Fenilfenol
3,2
pKa = 9,54
41
89-83-8
Timol
3,3
42
106-46-7
1,4-Diclorobenceno
3,4
43
122-39-4
Difenilamina
3,4
pKa = 0,79
44
91-20-3
Naftaleno
3,6
45
93-99-2
Benzoato de fenilo
3,6
46
98-82-8
Isopropilbenceno
3,7
47
88-06-2
2,4,6-Triclorofenol
3,7
pKa = 6
48
92-52-4
Bifenilo
4,0
49
120-51-4
Benzoato de bencilo
4,0
50
88-85-7
2,4-Dinitro-6-sec-butilfenol
4,1
51
120-82-1
1,2,4-Triclorobenceno
4,2
52
143-07-7
Ácido dodecanoico
4,2
pKa = 5,3
53
101-84-8
Éter difenílico
4,2
54
85-01-8
Fenantreno
4,5
55
104-51-8
n-Butilbenceno
4,6
56
103-29-7
Dibencilo
4,8
57
3558-69-8
2,6-Difenilpiridina
4,9
58
206-44-0
Fluoranteno
5,1
59
603-34-9
Trifenilamina
5,7
60
50-29-3
DDT
6,5
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Estimación previa del coeficiente de reparto
16.
Si es necesario, puede estimarse el coeficiente de reparto de la sustancia problema, preferentemente mediante un método de cálculo (véase el apéndice), o bien, cuando sea adecuado, utilizando la relación de las solubilidades de la sustancia problema en los disolventes puros.
Equipo
17.
Se debe disponer de un cromatógrafo de líquidos provisto de una bomba de baja pulsación y un sistema adecuado de detección. Un detector de UV, con una longitud de onda de 210 nm, o un detector de índice de refracción, es aplicable a una amplia variedad de grupos químicos. La presencia de grupos polares en la fase estacionaria puede afectar gravemente al funcionamiento de la columna de HPLC; por tanto, las fases estacionarias deben presentar la mínima proporción posible de grupos polares (16). Pueden utilizarse rellenos de fase inversa con micropartículas o columnas ya rellenas, disponibles comercialmente. Puede ponerse una precolumna entre el sistema de inyección y la columna de análisis.
Fase móvil
18.
Para preparar el disolvente de elución, se utilizan metanol de grado HPLC y agua destilada o desionizada; el disolvente se desgasifica antes de utilizarse. Se debe utilizar una elución isocrática. Deben utilizarse mezclas de metanol/agua con un contenido mínimo de agua del 25 %. La mezcla típica de metanol-agua en la proporción de 3:1 (v/v) es satisfactoria para eluir sustancias de log P igual a 6 en el plazo de una hora, con un caudal de 1 ml/min. En el caso de sustancias de log P mayor de 6, puede ser necesario abreviar su tiempo de elución (y el de las sustancias de referencia) disminuyendo la polaridad de la fase móvil o la longitud de la columna.
19.
La sustancia problema y las sustancias de referencia deben ser solubles en la fase móvil en concentración suficiente para permitir su detección. Se podrán utilizar aditivos con la mezcla metanol-agua solo en casos excepcionales, ya que cambian las propiedades de la columna. En estos casos, debe comprobarse que los tiempos de retención de las sustancias problema y de referencia no se ven afectados. Si la mezcla metanol-agua no es adecuada, pueden utilizarse mezclas de agua con otros disolventes orgánicos, como etanol, acetonitrilo, o 2-propanol (alcohol isopropílico).
20.
El pH del eluyente es fundamental para las sustancias ionizables. Debe situarse en el intervalo de pH de funcionamiento de la columna, que suele estar entre 2 y 8. Se recomienda el uso de soluciones amortiguadoras. Hay que evitar la precipitación de sales y el deterioro de la columna que se producen con algunas mezclas de fase orgánica con soluciones amortiguadoras. Las medidas de HPLC con fases estacionarias a base de sílice con pH superior a 8 no suelen ser recomendables porque el uso de una fase móvil alcalina puede provocar una rápida alteración de las características de la columna.
Solutos
21.
Las sustancias problema y de referencia deben ser suficientemente puras a fin de asignar los picos de los cromatogramas a las sustancias respectivas. Si es posible, las sustancias que se vayan a utilizar en el ensayo o en la calibración se disolverán en la fase móvil. Si se utiliza un disolvente distinto de la fase móvil para disolver las sustancias problema y de referencia, la fase móvil debe utilizarse para la dilución final antes de la inyección.
Condiciones de ensayo
22.
La temperatura durante las medidas no debe variar más de ± 1 °C.
Determinación del tiempo muerto t0
23.
El tiempo muerto t0 puede medirse utilizando sustancias orgánicas que no se retienen (p. ej., tiourea o formamida). Puede obtenerse el tiempo muerto con más precisión a partir de los tiempos de retención medidos del conjunto de unos siete miembros de una serie homóloga (por ejemplo, n-alquil-metil-cetonas) (17). Se representan los tiempos de retención tR (nC+ 1) frente a tR (nC), donde nC es el número de átomos de carbono. Se obtiene una línea recta, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, donde A, que representa a k (nC + 1)/k (nC), es una constante. El tiempo muerto t0 se obtiene a partir de la ordenada en el origen (1 – A)t0 y de la pendiente A.
Ecuación de regresión
24.
El siguiente paso es representar la correlación entre log k y log P de sustancias de referencia adecuadas, con valores de log P cercanos al valor previsto de la sustancia problema. En la práctica, se inyectan simultáneamente de 6 a 10 sustancias de referencia. Se determinan los tiempos de retención, de preferencia con un integrador-registrador unido al sistema de detección. Se representan en función de log P los correspondientes logaritmos de los factores de capacidad, log k. La ecuación de regresión se realiza a intervalos regulares, al menos una vez al día, de forma que puedan tenerse en cuenta los posibles cambios de las características de la columna.
DETERMINACIÓN DEL POW DE LA SUSTANCIA PROBLEMA
25.
Se inyectan las cantidades más pequeñas detectables de la sustancia problema. Se determina por duplicado el tiempo de retención. El coeficiente de reparto de la sustancia problema se obtiene por interpolación del factor de capacidad calculado en la curva de calibración. En caso de coeficientes de reparto muy bajos y muy altos, es necesario hacer una extrapolación. Especialmente en estos casos debe prestarse atención a los límites de confianza de la línea de regresión. Si el tiempo de retención de la muestra se sitúa fuera de la gama de tiempos de retención obtenidos con los patrones, tiene que darse un valor límite.
DATOS E INFORME
Informe del ensayo
26.
Los siguientes elementos deberán incluirse en el informe:
—
si se ha efectuado una estimación previa del coeficiente de reparto, los valores estimados y el método utilizado; y, si se ha utilizado un método de cálculo, su descripción completa, incluida la identificación de la base de datos e información detallada sobre la selección de los fragmentos;
—
sustancias problema y de referencia: pureza, fórmula estructural y número CAS;
—
descripción del equipo y de las condiciones de funcionamiento: columna de análisis, precolumna;
—
fase móvil, medio de detección, intervalo de temperatura, pH;
—
perfiles de elución (cromatogramas);
—
tiempo muerto y método para medirlo;
—
datos de la retención y valores de log Pow de la bibliografía correspondientes a las sustancias de referencia utilizadas en la calibración;
—
datos de la recta de regresión ajustada (log k frente a log Pow) y coeficiente de correlación de la recta, incluidos los intervalos de confianza;
—
datos de retención media y valor interpolado de log Pow de la sustancia problema;
—
en el caso de una mezcla: cromatograma del perfil de elución con indicación de los valores de corte;
—
valores de log Pow en relación con el porcentaje del área del pico de log Pow;
—
cálculo utilizando una recta de regresión;
—
media ponderada calculada de los valores de log Pow, cuando corresponda.
BIBLIOGRAFÍA
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(11)
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(12)
J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.
(13)
S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.
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C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. Wiley, Nueva York.
(15)
C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity — Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.
(16)
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(17)
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Apéndice
Métodos de cálculo del POW
INTRODUCCIÓN
1.
El presente apéndice proporciona una breve introducción al cálculo del Pow. Para más información, se remite al lector a los libros de texto (1) (2).
2.
Los valores calculados de Pow se utilizan para:
—
decidir qué método experimental se debe utilizar: método de frasco de agitación para log Pow entre – 2 y 4, y método de HPLC para log Pow entre 0 y 6;
—
seleccionar las condiciones que deben utilizarse en la HPLC (sustancias de referencia, proporción metanol/agua);
—
controlar la verosimilitud de los valores obtenidos mediante métodos experimentales;
—
proporcionar una estimación cuando no puedan aplicarse los métodos experimentales.
Principio de los métodos de cálculo
3.
Los métodos de cálculo aquí sugeridos se basan en la fragmentación teórica de la molécula en subestructuras adecuadas de las que se conocen incrementos fiables de log Pow. El log Pow se obtiene sumando los valores de los fragmentos y los términos de corrección por las interacciones intramoleculares. Existen listas de constantes de fragmentos y términos de corrección (1) (2) (3) (4) (5) (6). Algunas se actualizan periódicamente (3).
Fiabilidad de los valores calculados
4.
En general, la fiabilidad de los métodos de cálculo disminuye según aumenta la complejidad de la sustancia estudiada. En el caso de las moléculas simples de bajo peso molecular y uno o dos grupos funcionales, puede esperarse una desviación de 0,1 a 0,3 unidades de log Pow entre los resultados de los diferentes métodos de fragmentación y los valores medidos. El margen de error dependerá de la fiabilidad de las constantes de fragmentos utilizadas, de la capacidad de reconocer interacciones intramoleculares (p. ej., enlaces de hidrógeno) y del uso adecuado de los términos de corrección. En el caso de sustancias que se ionizan, han de tenerse en cuenta la carga y el grado de ionización (10).
Método de π de Fujita-Hansch
5.
La constante de hidrofobicidad del sustituyente, π, introducida originalmente por Fujita et al. (7) se define de la manera siguiente:
πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)
donde PhX es un derivado aromático y PhH es la sustancia original,
p. ej.,
πCl
= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)
= 2,84 – 2,13
= 0,71
El método de π es interesante sobre todo para sustancias aromáticas. Se dispone de los valores de π de un gran número de sustituyentes (4) (5).
Método de Rekker
6.
Con el método de Rekker (8), el valor de log Pow se calcula de la forma siguiente:
Formula
donde ai es el número de veces que un fragmento dado aparece en la molécula y fi es el incremento de log Pow del fragmento. Los términos de interacción pueden expresarse como integral múltiple de una sola constante Cm (llamada “constante mágica”). Las constantes de fragmento fi y Cm se han obtenido a partir de una lista de 1 054 valores experimentales de Pow de 825 sustancias mediante análisis de regresión múltiple (6) (8). La determinación de los términos de interacción se lleva a cabo según normas establecidas (6) (8) (9).
Método de Hansch-Leo
7.
Con el método de Hansch y Leo (4), el valor de log Pow se calcula de la forma siguiente:
Formula
donde fi es una constante de fragmento, Fj es un término de corrección (factor), y ai y bj son la frecuencia correspondiente de presencia. Las listas de valores de fragmentos (de átomos y de grupos) y de términos de corrección Fj se obtuvieron por tanteo a partir de valores experimentales de Pow. Los términos de corrección se han dividido en varias clases diferentes (1) (4). Se han desarrollado paquetes de programas informáticos para tener en cuenta todas las normas y términos de corrección (3).
MÉTODO COMBINADO
8.
El cálculo de log Pow de moléculas complejas puede mejorarse considerablemente si se divide la molécula en grandes subestructuras de las que se conozcan valores fiables de log Pow, bien a partir de listas (3) (4) o bien por mediciones previas. Estos fragmentos (p. ej., heterociclos, antraquinona, azobenceno) pueden combinarse con los valores π de Hansch o con las constantes de fragmento de Rekker o Leo.
Observaciones
i)
Los métodos de cálculo son aplicables a las sustancias parcial o completamente ionizadas solo cuando se tienen en cuenta los necesarios factores de corrección.
ii)
Si puede suponerse la presencia de enlaces de hidrógeno intramoleculares, hay que añadir los correspondientes términos de corrección (aproximadamente, de + 0,6 a + 1,0 unidades de log Pow) (1). Pueden obtenerse indicaciones sobre la presencia de tales enlaces a partir de modelos estéricos o datos espectroscópicos.
iii)
Si son posibles varias formas tautoméricas, debe usarse como base para el cálculo la forma más probable.
iv)
Hay que seguir cuidadosamente las revisiones de las listas de constantes de fragmento.
BIBLIOGRAFÍA SOBRE MÉTODOS DE CÁLCULO
(1)
W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, Nueva York (1982).
(2)
W.J. Dunn, J.H. Block and R.S. Pearlman (ed.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (Nueva York) y Oxford (1986).
(3)
Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, EE.UU., Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).
(4)
C. Hansch and A.J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, Nueva York (1979).
(5)
Leo, C. Hansch and D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.
(6)
R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 14, 479.
(7)
(8)
R.F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, Nueva York (1977).
(9)
C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.
(10)
R.A. Scherrer. ACS — Symposium Series 255, p. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).
»
3)
El capítulo C.3 se sustituye por el texto siguiente:
«
C. 3. PRUEBA DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE ALGAS Y CIANOBACTERIAS DE AGUA DULCE
INTRODUCCIÓN
1.
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 201 (2006, anexo corregido en 2011). Se ha señalado la necesidad de ampliar el método de ensayo para incluir más especies y actualizarlo para cumplir los requisitos de evaluación del peligro y clasificación de sustancias. Esta revisión se ha efectuado basándose en la amplia experiencia práctica, en los avances científicos en el campo de los estudios toxicológicos de las algas y en la amplia aplicación con fines reglamentarios que ha tenido lugar desde la adopción inicial.
2.
En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
3.
El objeto de este ensayo es determinar los efectos de una sustancia sobre el crecimiento de microalgas o cianobacterias de agua dulce. Los organismos del ensayo, en fase de crecimiento exponencial, se exponen a la sustancia problema en cultivos discontinuos, normalmente durante un plazo de 72 horas. A pesar de la relativamente reducida duración del ensayo, es posible evaluar los efectos sobre varias generaciones.
4.
La respuesta del sistema es la reducción del crecimiento en una serie de cultivos de algas (unidades de ensayo) expuestos a distintas concentraciones de una sustancia problema. La respuesta se evalúa como función de la concentración de exposición comparándola con el crecimiento medio en cultivos de control (sin exposición) replicados. Para que se exprese plenamente la respuesta del sistema a los efectos tóxicos (sensibilidad óptima), se permite que los cultivos crezcan exponencialmente sin ninguna restricción, con la presencia de suficientes nutrientes y luz continua durante un tiempo suficiente para medir la reducción de la tasa de crecimiento específico.
5.
El crecimiento y su inhibición se cuantifican midiendo la biomasa de las algas en función del tiempo. La biomasa de las algas se define como el peso seco por volumen, por ejemplo mg de algas/litro de solución problema. Sin embargo, es difícil medir el peso seco, por lo que se utilizan parámetros indicadores. De estos indicadores los más utilizados son los recuentos celulares. Otros parámetros indicadores son el volumen celular, la fluorescencia, la densidad óptica, etc. Debe disponerse de un factor de conversión entre el parámetro indicador y la biomasa.
6.
El efecto estudiado es la inhibición del crecimiento, expresado como aumento logarítmico de la biomasa (tasa media de crecimiento específico) durante el tiempo de exposición. A partir de las tasas medias de crecimiento específico registradas en una serie de soluciones de ensayo, se determina la concentración que produce una inhibición especificada del x % de la tasa de crecimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como ErCx (por ejemplo, ErC50).
7.
Otra variable de respuesta utilizada en este método de ensayo es el rendimiento, lo que puede ser necesario en algunos países para cumplir obligaciones específicas derivadas de la normativa. Se define como la biomasa al final del tiempo de exposición menos la biomasa al inicio de este tiempo. A partir del rendimiento registrado en una serie de soluciones de ensayo, se calcula la concentración que produce una inhibición especificada del x % del rendimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como EyCx (por ejemplo, EyC50).
8.
Además, pueden determinarse estadísticamente la concentración mínima con efecto observado (LOEC) y la concentración sin efecto observado (NOEC).
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA
9.
Entre la información sobre la sustancia problema que puede ser útil para establecer las condiciones del ensayo figuran su fórmula estructural, pureza, estabilidad ante la luz, estabilidad en las condiciones del ensayo, propiedades de absorción de la luz, pKa y resultados de estudios de transformación, incluida la biodegradabilidad en el agua.
10.
Deben conocerse la hidrosolubilidad, el coeficiente de reparto octanol/agua (Pow) y la presión de vapor de la sustancia problema, y debe disponerse de un método validado para cuantificar la sustancia en las soluciones problema con una eficiencia de recuperación y un límite de detección establecidos.
VALIDEZ DEL ENSAYO
11.
Para que un ensayo sea válido, su realización debe cumplir los siguientes criterios:
—
La biomasa de los cultivos de control debe haber aumentado exponencialmente con un factor de al menos 16 en el plazo de las 72 horas del ensayo. Esto corresponde a una tasa de crecimiento específico de 0,92 días– 1. Con las especies más utilizadas, la tasa de crecimiento suele ser mucho mayor (véase el apéndice 2). Este criterio puede no cumplirse si se utilizan especies de crecimiento más lento que las indicadas en el apéndice 2. En tal caso, debe prolongarse el plazo de ensayo hasta obtener un crecimiento por un factor de al menos 16 en los cultivos de control, siendo exponencial el crecimiento durante todo este tiempo. El plazo de ensayo puede reducirse hasta un mínimo de 48 horas para mantener el crecimiento exponencial sin límites durante el ensayo, siempre que se cumpla el requisito de un factor de multiplicación mínimo de 16.
—
El coeficiente promedio de variación de las tasas de crecimiento específico de cada sección (días 0-1, 1-2 y 2-3, en caso de ensayo de 72 horas) en los cultivos de control (véase “Coeficiente de variación” en el apéndice 1) no debe pasar del 35 %. Para el cálculo de la tasa de crecimiento específico de cada sección, véase el punto 49. Este criterio se aplica al valor promedio de los coeficientes de variación calculados de los cultivos de control replicados.
—
El coeficiente de variación de las tasas medias de crecimiento específico durante toda la duración del ensayo en los cultivos de control replicados no debe superar el 7 % en ensayos con Pseudokirchneriella subcapitata y Desmodesmus subspicatus. Con otras especies menos utilizadas, el valor no debe superar el 10 %.
SUSTANCIA DE REFERENCIA
12.
Para comprobar el procedimiento del ensayo pueden someterse a ensayo una o varias sustancias de referencia, como el 3,5-diclorofenol utilizado en el ensayo interlaboratorios internacional (1). También puede utilizarse el dicromato de potasio como sustancia de referencia con algas verdes. Es aconsejable someter a ensayo una sustancia de referencia al menos dos veces al año.
APLICABILIDAD DEL ENSAYO
13.
Este método de ensayo se aplica más fácilmente a las sustancias hidrosolubles que, en las condiciones del ensayo, tienen probabilidad de permanecer en el agua. Para el ensayo de sustancias volátiles, que se adsorben fuertemente, coloreadas, poco hidrosolubles o que pueden afectar a la disponibilidad de nutrientes o minerales en el medio de ensayo, puede ser necesario modificar el procedimiento descrito (por ejemplo, sistema cerrado, acondicionamiento de los recipientes de ensayo). En las referencias (2), (3) y (4) se dan orientaciones sobre algunas modificaciones pertinentes.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO
Equipo
14.
Los recipientes de ensayo y demás instrumentos que hayan de entrar en contacto con las soluciones de ensayo serán íntegramente de vidrio o de otro material químicamente inerte. Todos los artículos se lavarán cuidadosamente para que no tengan contaminantes orgánicos ni inorgánicos que puedan interferir con el crecimiento de las algas o con la composición de las soluciones problema.
15.
Los recipientes de ensayo serán en principio matraces de vidrio de dimensiones que permitan acoger un volumen suficiente de cultivo para la realización de mediciones durante el ensayo y la entrada de una masa suficiente de CO2 desde la atmósfera (véase el punto 30). Téngase en cuenta que el volumen de líquido debe ser suficiente para que se efectúen las determinaciones analíticas (véase el punto 37).
16.
Además, puede hacer falta el siguiente equipo, en todo o en parte:
—
Dispositivo de cultivo: se recomienda una cámara o recinto en que se pueda mantener la temperatura elegida de incubación con una precisión de ± 2 °C.
—
Instrumentos de medición de la luz: es importante tener en cuenta que el método de medición de la intensidad luminosa y, en particular, el tipo de receptor (colector) pueden afectar al valor medido. Las mediciones deben hacerse preferentemente utilizando un receptor esférico (4 π) (que responda a la luz directa y reflejada desde todos los ángulos por encima y por debajo del plano de medición) o un receptor 2 π (que responda a la luz desde todos los ángulos por encima del plano de medición).
—
Dispositivo para determinar la biomasa de las algas. El recuento celular, que es el parámetro indicador más utilizado para determinar la biomasa de las algas, puede efectuarse con un contador electrónico de partículas, un microscopio con cámara de recuento, o un citómetro de flujo. Es posible medir otros parámetros indicadores con un citómetro de flujo, un fluorímetro, un espectrofotómetro o un colorímetro. Es útil calcular un factor de conversión que relacione el recuento celular con el peso seco. Para obtener mediciones útiles con bajas concentraciones de biomasa cuando se utilice un espectrofotómetro, puede ser necesario utilizar cubetas con un paso de luz de 4 cm como mínimo.
Organismos de ensayo
17.
Pueden utilizarse diversas especies de microalgas y cianobacterias sueltas. Se ha visto que las cepas citadas en el apéndice 2 son adecuadas para el procedimiento especificado en este método de ensayo.
18.
Si se utilizan otras especies, debe mencionarse en el informe el nombre o el origen de las cepas. Ha de confirmarse que el crecimiento exponencial de las algas seleccionadas puede mantenerse durante toda la duración del ensayo en las condiciones reinantes.
Medio de cultivo
19.
Se recomiendan dos medios de cultivo: el medio de la OCDE y el medio AAP. Sus composiciones se muestran en el apéndice 3. Téngase en cuenta que el valor inicial de pH y la capacidad de amortiguación (regulación del aumento del pH) son diferentes en los dos medios. Por tanto, los resultados de los ensayos pueden ser diferentes según el medio utilizado, en particular cuando se estudien sustancias que se ionizan.
20.
Puede ser necesario modificar los medios de cultivo en ciertos casos, por ejemplo para estudiar metales y agentes quelantes o para efectuar el ensayo a diferentes valores de pH. Si se modifica un medio, es necesario describir con detalle y justificar la modificación (3) (4).
Concentración inicial de biomasa
21.
La biomasa inicial de los cultivos de ensayo debe ser la misma en todos ellos y lo bastante baja para que pueda darse crecimiento exponencial a lo largo de todo el período de incubación sin peligro de que se agoten los nutrientes. La biomasa inicial no debe superar los 0,5 mg/l en peso seco. Se recomiendan las siguientes concentraciones celulares al inicio:
Pseudokirchneriella subcapitata:
5 × 103 – 104 células/ml
Desmodesmus subspicatus:
2-5 × 103 células/ml
Navicula pelliculosa:
104 células/ml
Anabaena flos-aquae:
104 células/ml
Synechococcus leopoliensis:
5 × 104 – 105 células/ml
Concentraciones de la sustancia problema
22.
Se pueden efectuar pruebas preliminares para determinar el intervalo de concentraciones en el que es previsible que ocurran los efectos. Para el ensayo definitivo deben seleccionarse al menos cinco concentraciones dispuestas en una progresión geométrica de razón no superior a 3,2. En caso de sustancias problema que presenten una curva concentración-respuesta plana, puede justificarse una razón más elevada. La serie de concentraciones debe abarcar preferentemente el intervalo que provoca una inhibición del 5 a 75 % de la tasa de crecimiento de las algas.
Réplicas y controles
23.
Cada concentración de ensayo contará con tres réplicas. Si no es necesario determinar la NOEC, el diseño de la prueba puede modificarse para aumentar el número de concentraciones y reducir el número de réplicas por concentración. El número de réplicas de control debe ser como mínimo de tres, aunque se recomienda que sea el doble del número de réplicas utilizadas con cada concentración de ensayo.
24.
Puede prepararse una serie aparte de soluciones problema para efectuar las determinaciones analíticas de las concentraciones de la sustancia problema (véanse los puntos 36 y 38).
25.
Cuando se utiliza un disolvente para solubilizar la sustancia problema, el diseño del ensayo debe incluir controles adicionales con el disolvente a la misma concentración utilizada en los cultivos de ensayo.
Preparación del cultivo de inóculo
26.
Para adaptar las algas a las condiciones del ensayo y garantizar que se encuentran en fase de crecimiento exponencial cuando se utilicen para inocular las soluciones problema, debe prepararse un cultivo de inóculo en el medio de ensayo de 2 a 4 días antes del inicio del ensayo. La biomasa de las algas debe ajustarse para que se dé crecimiento exponencial en el cultivo de inóculo hasta que empiece el ensayo. El cultivo de inóculo se incuba en las mismas condiciones que los cultivos de ensayo. Ha de medirse el aumento de la biomasa en el cultivo de inóculo para asegurarse de que el crecimiento está en el intervalo normal de la cepa utilizada en las condiciones de cultivo aplicadas. En el apéndice 4 se describe un ejemplo de procedimiento de cultivo de algas. Para evitar divisiones celulares sincrónicas durante el ensayo, puede ser necesario efectuar una segunda fase de propagación del cultivo de inóculo.
Preparación de las soluciones problema
27.
Todas las soluciones problema deben contener las mismas concentraciones de medio de cultivo y la misma biomasa inicial de algas. Las soluciones problema de las concentraciones elegidas se preparan normalmente mezclando una solución madre de la sustancia problema con medio de cultivo y con cultivo de inóculo. En principio, estas soluciones madre se preparan disolviendo la sustancia en medio de ensayo.
28.
Pueden utilizarse disolventes (por ejemplo, acetona, alcohol t-butílico y dimetil-formamida) como vehículo para añadir al medio de ensayo sustancias poco hidrosolubles (2) (3). La concentración del disolvente no debe superar los 100 μl/l, y debe ser igual en todos los cultivos (incluidos los controles) de la serie de ensayo.
Incubación
29.
Los recipientes de ensayo deben taparse con tapones permeables al aire. Se agitan los recipientes y se colocan en el dispositivo de cultivo. Durante el ensayo es necesario mantener las algas en suspensión y facilitar el paso del CO2, por lo que debe efectuarse una agitación constante. Los cultivos deben mantenerse a una temperatura entre los 21 y los 24 °C, con variaciones máximas de ± 2 °C. En caso de especies distintas de las indicadas en el apéndice 2 como, por ejemplo, especies tropicales, puede ser apropiada una temperatura superior, siempre que se puedan cumplir los criterios de validez. Se recomienda distribuir aleatoriamente los matraces en la incubadora y cambiarlos de posición cada día.
30.
El pH del medio de control no debe subir más de 1,5 unidades durante el ensayo. En caso de metales y sustancias que se ionicen parcialmente a un pH próximo al del ensayo, puede ser necesario limitar la variación de pH para obtener unos resultados reproducibles y bien definidos. Técnicamente puede conseguirse una variación < 0,5 unidades de pH procurando una entrada suficiente de CO2 a la solución problema desde la atmósfera ambiente, por ejemplo aumentando la intensidad de la agitación. Otra posibilidad es contener la demanda de CO2 reduciendo la biomasa inicial o la duración del ensayo.
31.
La superficie en que se incuban los cultivos debe recibir una iluminación fluorescente uniforme y continua, por ejemplo del tipo “blanca fría” o “diurna”. Las necesidades de luz de las algas y cianobacterias varían con la cepa. Debe seleccionarse la intensidad luminosa que sea más adecuada para el organismo utilizado en el ensayo. Si se utilizan las especies recomendadas de algas verdes, la intensidad luminosa al nivel de las soluciones problema debe estar en el intervalo de 60 a 120 μE · m– 2 · s– 1 cuando se mide en la banda de longitudes de onda correspondiente a la fotosíntesis (400 - 700 nm) utilizando un receptor adecuado. Algunas especies, en particular Anabaena flos-aquae, crecen bien con intensidades luminosas más bajas y pueden sufrir daños con intensidades superiores. Para tales especies debe elegirse una intensidad luminosa media en el intervalo de 40 a 60 μE · m– 2· s– 1. (Con instrumentos de medición de la luz calibrados en luxes, una gama equivalente de 4 440 a 8 880 lux con luz blanca fría corresponde aproximadamente a la intensidad luminosa recomendada de 60 a 120 μE · m– 2 · s– 1.) En toda la superficie de incubación debe mantenerse la intensidad luminosa dentro de un margen de ± 15 % respecto a la intensidad luminosa media.
Duración del ensayo
32.
La duración del ensayo es en principio de 72 horas. Sin embargo, pueden elegirse duraciones más largas o más breves, siempre que se puedan cumplir todos los criterios de validez del punto 11.
Mediciones y determinaciones analíticas
33.
La biomasa de las algas de cada matraz se determina al menos una vez al día mientras dure el ensayo. Si se toman con pipeta pequeños volúmenes de la solución problema para efectuar mediciones, dichos volúmenes no deben reponerse.
34.
La medición de la biomasa se efectúa por recuento manual de células con microscopio o bien con un contador electrónico de partículas (por recuento de células o biovolumen). Pueden utilizarse otras técnicas como, por ejemplo, la citometría de flujo, la fluorescencia clorofílica in vitro o in vivo (5) (6), o la densidad óptica, siempre que se pueda demostrar una correlación satisfactoria con la biomasa en todo el intervalo de biomasas correspondiente al ensayo.
35.
El pH de las soluciones debe medirse tanto al principio como al final del ensayo.
36.
Siempre que se disponga de un método analítico para la determinación de la sustancia problema en el intervalo de concentraciones utilizadas, debe procederse a analizar las soluciones problema para verificar las concentraciones iniciales y el mantenimiento de las concentraciones de exposición durante el ensayo.
37.
Puede ser suficiente analizar la concentración de la sustancia problema al inicio y al final del ensayo a una concentración de ensayo baja y a otra alta, así como a una concentración próxima a la EC50 prevista, si es probable que las concentraciones de exposición varíen durante el ensayo en menos del 20 % respecto a sus valores nominales. Se recomienda el análisis a todas las concentraciones de ensayo al inicio y al final del ensayo si es poco probable que las concentraciones permanezcan en la banda del 80 al 120 % de su valor nominal. En caso de sustancias problema que sean volátiles, inestables o se adsorban fuertemente, se recomienda tomar muestras adicionales para analizarlas a intervalos de 24 horas durante el período de exposición, a fin de definir mejor las pérdidas de sustancia problema. Para estas sustancias es posible que se necesiten más réplicas. En todos los casos, la determinación de las concentraciones de la sustancia problema solo tendrá que efectuarse en uno de los recipientes replicados de cada concentración de ensayo (o en los contenidos de los recipientes reunidos por replicado).
38.
Los medios de ensayo preparados específicamente para el análisis de las concentraciones de exposición durante el ensayo se tratarán de la misma forma que los empleados para el ensayo, es decir, se inocularán con algas y se incubarán en condiciones idénticas. Si hace falta analizar la concentración de la sustancia problema disuelta, puede ser necesario separar las algas del medio. Se recomienda hacer la separación por centrifugación con una fuerza g baja, suficiente para sedimentar las algas.
39.
Si está demostrado que la concentración de la sustancia problema se ha mantenido satisfactoriamente a lo largo de todo el ensayo dentro de un intervalo de ± 20 % de la concentración nominal o de la medida inicialmente, el análisis de los resultados puede basarse en los valores nominales o medidos inicialmente. Si la desviación respecto a la concentración nominal o medida inicialmente no está dentro del intervalo de ± 20 %, el análisis de los resultados debe basarse en la media geométrica de la concentración durante la exposición o en modelos que describan el descenso de la concentración de la sustancia problema (3) (7).
40.
El ensayo de inhibición del crecimiento de las algas es un sistema de ensayo más dinámico que la mayoría de los otros ensayos de toxicidad acuática a corto plazo. En consecuencia, puede ser difícil definir las concentraciones reales de exposición, especialmente cuando se estudian a baja concentración sustancias que se adsorben. En tales casos, la desaparición de la sustancia problema de la solución por su adsorción a la biomasa de las algas en aumento no significa que se haya separado del sistema de ensayo. Cuando se analice el resultado del ensayo, debe comprobarse si un descenso en la concentración de la sustancia problema a lo largo del ensayo va acompañado por un descenso de la inhibición del crecimiento. En caso afirmativo, puede estudiarse la aplicación de un modelo adecuado que describa el descenso de la concentración de la sustancia problema (7). En caso negativo, puede ser adecuado basar el análisis de los resultados en las concentraciones iniciales (nominales o medidas).
Otras observaciones
41.
Debe procederse a una observación microscópica para verificar que el aspecto del cultivo de inóculo es normal y sano y detectar un eventual aspecto anormal de las algas (que podría ser debido a la exposición a la sustancia problema) al final del ensayo.
Ensayo límite
42.
Bajo ciertas circunstancias, por ejemplo cuando un ensayo preliminar indica que la sustancia problema no tiene efectos tóxicos a concentraciones de hasta 100 mg/l, o hasta su límite de solubilidad en el medio de ensayo si este valor es más bajo, puede efectuarse un ensayo límite comparando las respuestas de un grupo de control y de un único grupo de tratamiento (100 mg/l o una concentración igual al límite de solubilidad). Se recomienda vivamente que esto se apoye en un análisis de la concentración de exposición. Todas las condiciones de ensayo y criterios de validez antes descritos son aplicables al ensayo límite, con la excepción de que el número de réplicas de tratamiento ha de ser como mínimo de seis. Las variables de respuesta en el grupo de control y en el de tratamiento pueden analizarse mediante un estudio estadístico para comparar las medias, por ejemplo una prueba t de Student. Si las varianzas de los dos grupos son desiguales, debe procederse a una prueba t ajustada para varianzas desiguales.
DATOS E INFORME
Trazado de las curvas de crecimiento
43.
La biomasa de los recipientes de ensayo puede expresarse en unidades del parámetro indicador utilizado para la medición (por ejemplo, número de células, fluorescencia).
44.
Ha de ponerse en un cuadro la concentración estimada de biomasa en los cultivos de ensayo y en los controles, junto con las concentraciones de la sustancia problema y los tiempos de las mediciones, registrados con una resolución mínima de horas completas, para trazar las curvas de crecimiento. En esta primera fase pueden ser útiles tanto las escalas logarítmicas como las lineales, pero las logarítmicas son obligatorias y en general presentan mejor las variaciones del ritmo de crecimiento durante el período de ensayo. Téngase en cuenta que el crecimiento exponencial da una línea recta cuando se representa en escala logarítmica, y que la inclinación de la línea (pendiente) indica la tasa de crecimiento específico.
45.
Utilizando las gráficas, ha de comprobarse si los cultivos de control crecen durante todo el ensayo exponencialmente y a la tasa prevista. Deben examinarse críticamente todos los puntos de datos y el aspecto de las gráficas, y ha de comprobarse que no hay errores en los datos en bruto ni en los procedimientos. Se deben comprobar en particular los puntos que parezcan desviarse por un error sistemático. Si está claro que pueden señalarse errores de procedimiento (o considerarse muy probable que los haya habido), el punto de datos concreto se marcará como anómalo y no se incluirá en el posterior análisis estadístico. (Una concentración de algas igual a cero en uno de dos o tres recipientes replicados puede indicar que el recipiente no se había inoculado correctamente, o que se había limpiado mal.) En el informe del ensayo deben constar claramente los motivos para rechazar un punto de datos por ser anómalo. Los motivos aceptados son solo los errores de procedimiento (raros), y no simplemente una mala precisión. Los métodos estadísticos para la detección de puntos anómalos tienen una utilidad limitada con este tipo de problema y no pueden sustituir al juicio de un experto. Es preferible mantener los puntos anómalos (señalados como tales) entre los puntos recogidos en cualquier presentación posterior de los datos en forma de gráfica o de cuadro.
Variables de respuesta
46.
El objetivo del ensayo es determinar los efectos de la sustancia problema sobre el crecimiento de las algas. El presente método de ensayo describe dos variables de respuesta, ya que las distintas jurisdicciones tienen distintas preferencias y necesidades reglamentarias. Para que los resultados del ensayo sean aceptables en todas las jurisdicciones, los efectos deben evaluarse utilizando las dos variables de respuesta a) y b) que se describen a continuación:
a) Tasa media de crecimiento específico : esta variable de respuesta se calcula basándose en el aumento logarítmico de la biomasa durante el período de ensayo, expresado por día.
b) Rendimiento : esta variable de respuesta es la biomasa al final del ensayo menos la biomasa al inicio.
47.
Ha de señalarse que los valores de toxicidad calculados a partir de estas dos variables de respuesta no son comparables y es necesario tener en cuenta esta diferencia cuando se utilicen los resultados del ensayo. Los valores de ECx basados en la tasa media de crecimiento específico (ErCx) son normalmente más elevados que los basados en el rendimiento (EyCx) si se respetan las condiciones del presente método de ensayo, debido al fundamento matemático de los planteamientos respectivos. Esto no debe interpretarse como una diferencia en la sensibilidad de las dos variables de respuesta, sino como una diferencia puramente matemática entre los valores. El concepto de tasa media de crecimiento específico se basa en el modelo general de crecimiento exponencial de las algas en cultivos no limitados, en el que la toxicidad se estima en función de los efectos sobre la tasa de crecimiento, sin depender del nivel absoluto de la tasa de crecimiento específico del control, de la pendiente de la curva concentración-respuesta ni de la duración del ensayo. Por el contrario, los resultados basados en la variable de respuesta “rendimiento” dependen de todas estas otras variables. La EyCx depende de la tasa de crecimiento específico de la especie de algas utilizada en cada ensayo y de la tasa máxima de crecimiento específico, que puede variar de una especie a otra e incluso de una cepa a otra. Esta variable de respuesta no debe utilizarse para comparar la sensibilidad de distintas especies o incluso distintas cepas ante un agente tóxico. Aunque científicamente se prefiere el uso de la tasa media de crecimiento específico para estimar la toxicidad, en el presente método de ensayo se incluye también la estimación a partir del rendimiento para cumplir los requisitos reglamentarios vigentes en ciertos países.
Tasa media de crecimiento
48.
La tasa media de crecimiento específico durante un período determinado se calcula como el incremento logarítmico de la biomasa en cada uno de los recipientes de control y de tratamiento, mediante la siguiente ecuación [1]:
Formula
[1],
donde:
μi – j
es la tasa media de crecimiento específico entre el tiempo i y el j;
Xi
es la biomasa en el tiempo i;
Xj
es la biomasa en el tiempo j.
Respecto a cada grupo de tratamiento y de control ha de calcularse un valor medio de la tasa de crecimiento y una estimación de la varianza.
49.
La tasa media de crecimiento específico a lo largo de toda la duración del ensayo (en principio, días 0-3) se calcula utilizando como valor inicial la biomasa teórica inoculada en vez de un valor inicial medido, ya que de esta manera puede obtenerse normalmente una precisión mayor. Si el equipo utilizado para la medición de la biomasa permite una determinación suficientemente precisa de la baja biomasa del inóculo (p. ej., citómetro de flujo), entonces puede utilizarse la concentración de biomasa inicial medida. También se determinará la tasa de crecimiento de cada sección, calculada como las tasas de crecimiento específico de cada día durante la realización del ensayo (días 0-1, 1-2 y 2-3) y se examinará si la tasa de crecimiento de los controles permanece constante (véanse los criterios de validez, punto 11). Una tasa específica de crecimiento del día 1 significativamente menor que la tasa media de crecimiento específico total puede indicar que hay una fase de latencia. Aunque es posible minimizar y eliminar prácticamente la fase de latencia en los cultivos de control mediante la propagación adecuada de un precultivo, una fase de latencia en los cultivos de tratamiento puede indicar que se produce una recuperación tras la agresión tóxica inicial o una reducción de la exposición por pérdida de sustancia problema (incluida la sorción en la biomasa de las algas) tras la exposición inicial. Por tanto, puede considerarse la tasa de crecimiento de cada sección para evaluar el efecto de la sustancia problema presente durante el período de exposición. Una diferencia importante entre la tasa de crecimiento de cada sección y la tasa media de crecimiento indica una desviación respecto al crecimiento exponencial constante e impone el examen en detalle de las curvas de crecimiento.
50.
El porcentaje de inhibición de la tasa de crecimiento de cada réplica de tratamiento se calcula con la siguiente ecuación [2]:
Formula
[2],
donde:
% Ir
es el porcentaje de inhibición de la tasa media de crecimiento específico;
μC
es el valor promedio de la tasa media de crecimiento específico (μ) en el grupo de control;
μT
es la tasa media de crecimiento específico en la réplica de tratamiento.
51.
Si se utilizan disolventes en la preparación de las soluciones problema, para el cálculo del porcentaje de inhibición deben emplearse controles con disolvente en vez de controles sin disolvente.
Rendimiento
52.
El rendimiento se calcula restando a la biomasa presente al final del ensayo la biomasa presente al inicio en cada recipiente de los controles y de los tratamientos. Respecto a cada concentración de ensayo y control ha de calcularse un valor promedio del rendimiento con una estimación de la varianza. El porcentaje de inhibición del rendimiento ( % Iy) puede calcularse de la manera siguiente con cada réplica de tratamiento:
Formula
[3],
donde:
% Iy
es el porcentaje de inhibición del rendimiento;
YC
es el valor promedio del rendimiento en el grupo de control;
YT
es el valor del rendimiento en la réplica de tratamiento.
Trazado de la curva concentración-respuesta
53.
Se representa el porcentaje de inhibición frente al logaritmo de la concentración de sustancia problema y se examina la gráfica obtenida, desechando los puntos de datos que se hayan marcado como anómalos en la primera fase. Se ajusta una línea regular a los puntos de datos, visualmente o mediante interpolación con ordenador, para obtener una primera impresión de la relación concentración-respuesta; después se aplica un método más detallado, de preferencia uno estadístico informatizado. En función del uso previsto de los datos, de la calidad (precisión) y cantidad de los mismos, así como de la disponibilidad de herramientas de análisis de los datos, puede decidirse (y a veces justificarse plenamente) terminar en esta fase el análisis de los datos para leer simplemente las cifras clave EC50 y EC10 (o EC20) a partir de la curva ajustada visualmente (véase también el punto siguiente sobre los efectos de estimulación). Pueden considerarse válidas las siguientes razones para no utilizar un método estadístico:
—
Los datos no son adecuados para producir, con métodos informatizados, resultados más fiables que los obtenidos por el juicio de un experto; en tales situaciones, es posible incluso que algunos programas informáticos no puedan proporcionar una solución fiable (las iteraciones pueden no converger, etc.).
—
Las respuestas de estimulación del crecimiento no pueden tratarse adecuadamente con los programas informáticos disponibles (véase más abajo).
Procedimientos estadísticos
54.
El objetivo es obtener una relación concentración-respuesta cuantitativa mediante análisis de regresión. Es posible utilizar una regresión lineal ponderada después de haber efectuado una transformación linealizante de los datos de respuesta como, por ejemplo, en probit o logit o unidades Weibull (8), pero son preferibles los procedimientos de regresión no lineal porque con ellos se tratan mejor las inevitables irregularidades de los datos y las desviaciones respecto a distribuciones regulares. Si la inhibición está próxima al 0 o al 100 %, la transformación puede magnificar tales irregularidades, interfiriendo así con el análisis (8). Debe señalarse que los métodos normales de análisis que utilizan las transformaciones en probit, logit o de Weibull están previstos para aplicarse a datos cuánticos (por ejemplo, mortalidad o supervivencia), y que es necesario modificarlos para aplicarlos a datos de crecimiento o biomasa. En las referencias (9), (10) y (11) pueden encontrarse métodos específicos de determinación de los valores de ECx a partir de datos continuos. En el apéndice 5 se da más información sobre el uso del análisis de regresión no lineal.
55.
Respecto a cada variable de respuesta que haya de analizarse, se utilizará la relación concentración-respuesta para calcular estimaciones puntuales de los valores de ECx. Cuando sea posible, se determinarán los límites de confianza del 95 % de cada estimación. La bondad del ajuste de los datos de respuesta al modelo de regresión se evaluará de forma gráfica o estadística. El análisis de regresión se efectuará utilizando las respuestas de las distintas réplicas y no los promedios de los grupos de tratamiento. Si, no obstante, es difícil o imposible el ajuste de una curva no lineal, debido a una dispersión demasiado grande de los datos, el problema puede evitarse efectuando la regresión con promedios de grupos como forma práctica de reducir la influencia de los puntos anómalos sospechados. El recurso a esta opción debe indicarse en el informe del ensayo como desviación del procedimiento normal porque el ajuste de la curva con los valores de las distintas réplicas no llevaba a un buen resultado.
56.
Las estimaciones de la EC50 y los límites de confianza pueden obtenerse también utilizando la interpolación lineal con remuestreo (bootstrapping) (13) si los métodos o modelos de regresión disponibles no son adecuados para los datos.
57.
Para la estimación de los valores de LOEC y, por tanto, de NOEC, en relación con los efectos de la sustancia problema sobre la tasa de crecimiento, es necesario comparar los promedios de tratamiento utilizando técnicas de análisis de la varianza (ANOVA). A continuación se ha de comparar el promedio obtenido a cada concentración con el del control, aplicando un método apropiado de comparación múltiple o de prueba de tendencia. Pueden ser útiles las pruebas de Dunnett o Williams (12) (14) (15) (16) (17). Hay que comprobar si se sostiene la hipótesis del ANOVA de homogeneidad de la varianza. Esta comprobación puede realizarse gráficamente o mediante una prueba en regla (17). Son adecuadas las pruebas de Levene o Bartlett. El incumplimiento de la hipótesis de homogeneidad de las varianzas puede corregirse a veces mediante la transformación logarítmica de los datos. Si la heterogeneidad de la varianza es extrema y no puede corregirse mediante transformación, ha de considerarse la posibilidad de efectuar un análisis por métodos como las pruebas de tendencia de Jonkheere de ajuste secuencial. En (11) puede encontrarse más información sobre la determinación de la NOEC.
58.
Los recientes avances científicos han llevado a recomendar el abandono del concepto de NOEC para sustituirlo por el de estimaciones puntuales de ECx basadas en la regresión. Aún no se ha determinado un valor adecuado de x para esta prueba con algas. Parece que es apropiado el intervalo del 10 al 20 % (según la variable de respuesta elegida) y lo mejor es indicar tanto la EC10 como la EC20.
Estimulación del crecimiento
59.
A veces se observa una estimulación del crecimiento (inhibición negativa) a bajas concentraciones. Esto puede deberse a la hormesis (“estimulación tóxica”) o a la adición de factores estimulantes del crecimiento al poner el material problema en el medio mínimo utilizado. Téngase en cuenta que la adición de nutrientes inorgánicos no debería tener ningún efecto directo porque el medio de ensayo ha de presentar un exceso de nutrientes a lo largo de todo ensayo. Normalmente, la estimulación a dosis bajas puede ignorarse al calcular la EC50, salvo en casos extremos. Sin embargo, cuando sea extrema o deba calcularse un valor de ECx para una x baja, puede ser necesario aplicar algún procedimiento especial. Siempre que sea posible debe evitarse la eliminación de las respuestas de estimulación del análisis de datos, y, si los programas informáticos disponibles para el ajuste de las curvas no son capaces de aceptar una estimulación poco importante, puede utilizarse la interpolación lineal con remuestreo (bootstrapping). Si la estimulación es extrema, puede considerarse la aplicación de un modelo de hormesis (18).
Inhibición del crecimiento de origen no tóxico
60.
Los materiales problema que absorben la luz pueden producir una reducción de la tasa de crecimiento porque el sombreado que provocan reduce la cantidad disponible de luz. Tales efectos de tipo físico deben distinguirse de los efectos tóxicos mediante la modificación de las condiciones del ensayo y deben figurar aparte en los informes. Puede encontrarse información al respecto en las referencias (2) y (3).
INFORME DEL ENSAYO
61.
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:
Sustancia problema:
—
naturaleza física y propiedades fisicoquímicas pertinentes, incluido el límite de hidrosolubilidad,
—
datos de identificación de la sustancia (por ejemplo, número CAS), incluida la pureza (impurezas).
Especie de ensayo:
—
cepa, proveedor u origen y condiciones de cultivo aplicadas.
Condiciones de ensayo:
—
fecha de inicio y duración del ensayo;
—
descripción del diseño del ensayo: recipientes de ensayo, volúmenes de cultivo, densidad de biomasa al inicio del ensayo,
—
composición del medio,
—
concentraciones de ensayo y réplicas (por ejemplo, número de réplicas en paralelo, número de concentraciones de ensayo y progresión geométrica utilizada),
—
descripción de la preparación de las soluciones de ensayo, incluido el uso de disolventes, etc.,
—
dispositivo de cultivo,
—
intensidad y calidad de la luz (fuente, homogeneidad),
—
temperatura,
—
concentraciones estudiadas: concentraciones nominales de ensayo y eventuales resultados de análisis para determinar la concentración de la sustancia problema en los recipientes de ensayo; deben comunicarse la eficiencia de recuperación del método y el límite de cuantificación de la matriz de ensayo,
—
todas las desviaciones respecto al presente método de ensayo,
—
método de determinación de la biomasa y pruebas de la correlación entre el parámetro medido y el peso seco.
Resultados:
—
valores de pH al inicio y al final del ensayo en todos los recipientes de tratamiento,
—
biomasa de cada matraz en cada punto de medida y método de medición de la biomasa,
—
curvas de crecimiento (gráfica de la biomasa frente al tiempo),
—
variables de respuesta calculadas de cada réplica de tratamiento, con valores medios y coeficiente de variación de las réplicas;
—
representación gráfica de la relación concentración-efecto,
—
estimaciones de la toxicidad correspondientes a las variables de respuesta como, p. ej., EC50, EC10, EC20, e intervalos de confianza asociados; en caso de que se calculen la LOEC y la NOEC, se indicarán sus valores y los métodos estadísticos utilizados en su determinación,
—
si se ha utilizado el ANOVA, el tamaño del efecto que puede observarse (por ejemplo, la diferencia significativa mínima),
—
la eventual estimulación del crecimiento que se haya observado en cualquier recipiente de tratamiento;
—
cualquier otro efecto observado como, por ejemplo, cambios morfológicos de las algas,
—
discusión de los resultados, incluida la eventual influencia que tengan sobre ellos las desviaciones respecto al presente método de ensayo.
BIBLIOGRAFÍA
(1)
Organización Internacional de Normalización (1993). ISO 8692. Calidad del agua. Ensayo de inhibición del crecimiento de algas.
(2)
Organización Internacional de Normalización (1998). ISO/DIS 14442. Calidad del agua. Guía general para los ensayos de inhibición del crecimiento de algas con materiales poco solubles, compuestos volátiles, metales y agua residual.
(3)
OCDE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, No. 23. Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos, París.
(4)
Organización Internacional de Normalización (1998). ISO 5667-16: Calidad del agua. Muestreo. Parte 16: Orientaciones sobre el bioensayo de las muestras.
(5)
Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.
(6)
(7)
Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L., and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Microbiol. Lett., Suppl. Chem. 22: 2073-2079.
(8)
Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.
(9)
Nyholm, N., Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.
(10)
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.
(11)
OCDE (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos, París.
(12)
Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121.
(13)
Norberg-King, T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.
(14)
Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.
(15)
Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.
(16)
Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.
(17)
Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, Nueva York.
(18)
Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
Apéndice 1
Definiciones
En relación con el presente método de ensayo se aplicarán las siguientes definiciones y abreviaturas:
Biomasa : peso seco de materia viva presente en una población y expresado en términos de un volumen dado como, por ejemplo, mg de algas por litro de solución problema. Generalmente, la “biomasa” se define como masa, pero en este ensayo la palabra se refiere a masa por volumen. También en este ensayo, lo que se mide normalmente son indicadores de la biomasa, como recuentos celulares, fluorescencia, etc., por lo que el término de “biomasa” se refiere también a estos indicadores.
Sustancia : sustancia o mezcla.
Coeficiente de variación : medida adimensional de la variabilidad de un parámetro, definida como el cociente entre la desviación típica y la media. Puede expresarse también como valor porcentual. El valor promedio del coeficiente de variación de una tasa media de crecimiento específico en cultivos de control replicados (en paralelo) debe calcularse de la manera siguiente:
1.
Se calcula el coeficiente de variación porcentual de la tasa media de crecimiento específico a partir de las tasas de crecimiento diarias (de cada sección) en las réplicas respectivas.
2.
Se calcula el valor medio de todos los valores calculados según el guion anterior para obtener el coeficiente medio de variación de la tasa de crecimiento específico diaria (de cada sección) en las réplicas de los cultivos de control.
ECx : concentración de la sustancia problema disuelta en el medio de ensayo que produce una reducción del x % (por ejemplo, del 50 %) en el crecimiento del organismo de ensayo dentro de un plazo de exposición definido (que debe indicarse explícitamente si es distinto de la duración completa o normal del ensayo). Para expresar de forma inequívoca el valor de EC obtenido a partir de la tasa de crecimiento o del rendimiento, se usan respectivamente los símbolos “ErC” y “EyC”.
Medio de cultivo : medio de cultivo sintético y completo en que crecen las algas del ensayo cuando se exponen a la sustancia problema. Esta se disuelve en principio en el medio de ensayo.
Tasa de crecimiento (tasa media de crecimiento específico): aumento logarítmico de la biomasa durante el período de exposición.
Concentración mínima con efecto observado (LOEC) : concentración estudiada mínima a la que se observa que la sustancia ejerce un efecto estadísticamente significativo de reducción del crecimiento (con p < 0,05) cuando se compara con el control, dentro de un tiempo de exposición dado. Sin embargo, es necesario también que todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC ejerzan un efecto nocivo superior o igual al que se observa con dicha concentración. Si no se cumplen estas dos condiciones, es preciso dar una explicación completa sobre cómo se ha elegido la LOEC (y, por tanto, la NOEC).
Concentración sin efecto observado (NOEC) : concentración estudiada que se encuentra inmediatamente por debajo de la LOEC.
Variable de respuesta : variable para la estimación de la toxicidad derivada de cualquier parámetro medido que describa la biomasa por distintos métodos de cálculo. A efectos del presente método, las tasas de crecimiento y el rendimiento son variables de respuesta obtenidas midiendo la biomasa directamente o bien mediante alguno de los parámetros indicadores mencionados.
Tasa de crecimiento específico : variable de respuesta definida como el cociente de la diferencia de los logaritmos neperianos de un parámetro de observación (en el presente método de ensayo, la biomasa) y el respectivo plazo de tiempo.
Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.
Rendimiento : valor de una variable de medición al final del período de exposición menos el valor de la variable de medición al inicio del período de exposición; indica el aumento de biomasa durante el ensayo.
Apéndice 2
Cepas conocidas por ser adecuadas para el ensayo
Algas verdes
Pseudokirchneriella subcapitata (antes conocida como Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG
Desmodesmus subspicatus (antes conocida como Scenedesmus subspicatus) 86.81 SAG
Diatomeas
Navicula pelliculosa, UTEX 664
Cianobacterias
Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A
Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1
Orígenes de las cepas
Las cepas recomendadas pueden conseguirse en forma de cultivos procedentes de una sola célula de alga en las siguientes colecciones (por orden alfabético):
ATCC: American Type Culture Collection
10801 University Boulevard
Manassas, Virginia 20110-2209
Estados Unidos
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa
Institute of Freshwater Ecology
Windermere Laboratory
Far Sawrey, Amblerside
Cumbria LA22 0LP
Reino Unido
SAG: Collection of Algal Cultures
Inst. Plant Physiology
Universität Göttingen
Nikolausberger Weg 18
37073 Gotinga
ALEMANIA
UTEX Culture Collection of Algae
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology
School of Biological Sciences
The University of Texas at Austin
Austin, Tejas 78712
EE.UU.
Aspecto y características de las especies recomendadas
P. subcapitata
D. subspicatus
N. pelliculosa
A. flos-aquae
S. leopoliensis
Aspecto
Células curvadas y retorcidas, aisladas
Células ovales, en su mayoría aisladas
Barras o varillas
Cadenas de células ovales
Barras o varillas
Tamaño (longitud × anchura) μm
8-14 × 2-3
7-15 × 3-12
7,1 × 3,7
4,5 × 3
6 × 1
Volumen celular (μm3/célula)
40-60 (2)
60-80 (2)
40-50 (2)
30-40 (2)
2,5 (3)
Peso seco celular (mg/célula)
2-3 × 10– 8
3-4 × 10– 8
3-4 × 10– 8
1-2 × 10– 8
2-3 × 10– 9
Tasa de crecimiento (4) (día– 1)
1,5-1,7
1,2-1,5
1,4
1,1-1,4
2,0-2,4
Recomendaciones específicas de cultivo y manipulación de las especies de ensayo recomendadas
Pseudokirchneriella subcapitata y Desmodesmus subspicatus
Generalmente es fácil mantener estas algas verdes en diversos medios de cultivo. Las colecciones de cultivos proveen de información sobre los medios adecuados. Las células están normalmente aisladas, y las mediciones de la densidad celular pueden efectuarse fácilmente con un contador electrónico de partículas o un microscopio.
Anabaena flos-aquae
Pueden utilizarse diversos medios de cultivo para mantener un cultivo madre. Es especialmente importante evitar que el cultivo discontinuo pase de la fase logarítmica de crecimiento al renovarse, ya que la recuperación es difícil después.
Anabaena flos-aquae forma agregados de cadenas encajadas de células. El tamaño de estos agregados puede cambiar según las condiciones de cultivo. Puede ser necesario romper estos agregados si, para determinar la biomasa, se hace un recuento con microscopio o se utiliza un contador electrónico de partículas.
Es posible someter submuestras a un baño de ultrasonidos para romper las cadenas, a fin de reducir la variabilidad del recuento. Si el baño dura más tiempo del necesario para romper las cadenas en segmentos más cortos, puede que se destruyan las células. La intensidad y la duración del baño de ultrasonidos deben ser las mismas con todos los recipientes de tratamiento.
Debe contarse un número suficiente de campos en el hemocitómetro (al menos 400 células) para compensar la variabilidad. Así mejora la fiabilidad de las determinaciones de densidad efectuadas con el microscopio.
Para la determinación del volumen celular total de Anabaena puede utilizarse un contador electrónico de partículas tras romper las cadenas de células mediante un baño de ultrasonidos aplicado cuidadosamente. Es necesario ajustar la energía de los ultrasonidos para evitar destruir las células.
Utilícese un agitador vórtex o un método similar adecuado a fin de que la suspensión de algas utilizada para inocular los recipientes de ensayo esté bien mezclada y sea homogénea.
Los recipientes de ensayo deben colocarse en un agitador orbital o recíproco, a unas 150 revoluciones por minuto. Otra posibilidad es utilizar una agitación intermitente para reducir la tendencia de Anabaena a agregarse. Si se produce la agregación, hay que tener cuidado para tomar muestras representativas con el fin de medir la biomasa. Para romper los agregados de algas puede ser necesario agitar vigorosamente antes de tomar la muestra.
Synechococcus leopoliensis
Pueden utilizarse diversos medios de cultivo para mantener un cultivo madre. Las colecciones de cultivos proveen de información sobre los medios adecuados.
Synechococcus leopoliensis crece en forma de células aisladas de forma cilíndrica. Las células son muy pequeñas, lo que hace difícil utilizar el recuento con microscopio para medir la biomasa. Son útiles los contadores electrónicos de partículas equipados para contar partículas de hasta un tamaño aproximado de 1 μm. También puede aplicarse la técnica de medición fluorométrica in vitro.
Navicula pelliculosa
Pueden utilizarse diversos medios de cultivo para mantener un cultivo madre. Las colecciones de cultivos proveen de información sobre los medios adecuados. Obsérvese el requisito de que el medio tenga silicato.
Navicula pelliculosa puede formar agregados en ciertas condiciones de crecimiento. Debido a la producción de lípidos, las células de las algas tienden a veces a acumularse en la película superficial. En tales circunstancias, hay que adoptar medidas especiales cuando se toman submuestras para la determinación de la biomasa a fin de que las muestras sean representativas. Puede ser necesario agitar enérgicamente, por ejemplo utilizando un mezclador vórtex.
Apéndice 3
Medios de cultivo
Puede utilizarse uno de los dos medios de cultivo siguientes:
—
Medio de la OCDE: medio original de las directrices de ensayo de la OCDE TG 201, también de acuerdo con la norma ISO 8692
—
Medio AAP de la EPA de Estados Unidos, también de acuerdo con la ASTM.
Para preparar estos medios deben utilizarse sustancias de grado analítico o reactivo y agua desionizada.
Composición del medio AAP (EPA de Estados Unidos) y del medio OCDE TG 201
Componente
AAP
OCDE
mg/l
mM
mg/l
mM
NaHCO3
15,0
0,179
50,0
0,595
NaNO3
25,5
0,300
NH4Cl
15,0
0,280
MgCl2 · 6 (H2O)
12,16
0,0598
12,0
0,0590
CaCl2 · 2 (H2O)
4,41
0,0300
18,0
0,122
MgSO4 · 7 (H2O)
14,6
0,0592
15,0
0,0609
K2HPO4
1,044
0,00599
KH2PO4
1,60
0,00919
FeCl3 · 6 (H2O)
0,160
0,000591
0,0640
0,000237
Na2EDTA · 2 (H2O)
0,300
0,000806
0,100
0,000269*
H3BO3
0,186
0,00300
0,185
0,00299
MnCl2 · 4 (H2O)
0,415
0,00201
0,415
0,00210
ZnCl2
0,00327
0,000024
0,00300
0,0000220
CoCl2 · 6 (H2O)
0,00143
0,000006
0,00150
0,00000630
Na2MoO4 · 2 (H2O)
0,00726
0,000030
0,00700
0,0000289
CuCl2 · 2 (H2O)
0,000012
0,00000007
0,00001
0,00000006
pH
7,5
8,1
La proporción molar del EDTA respecto al hierro sobrepasa ligeramente la unidad. Así se evita la precipitación del hierro y, a la vez, se reduce al mínimo la quelación de iones de metales pesados.
En el ensayo con la diatomea Navicula pelliculosa, ambos medios deben recibir un suplemento de Na2SiO3 · 9H20 para obtener una concentración de 1,4 mg Si/l.
El pH del medio se mide cuando se ha alcanzado el equilibrio entre el carbonato del medio y la presión parcial de CO2 del aire atmosférico. He aquí la relación aproximada entre el pH a 25 °C y la concentración molar de bicarbonato:
pHeq = 11,30 + log [HCO3]
Con 15 mg NaHCO3/l, pHeq = 7,5 (medio de la EPA de Estados Unidos) y con 50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (medio de la OCDE).
Composición en elementos de los medios de ensayo
Elemento
AAP
OCDE
mg/l
mg/l
C
2,144
7,148
N
4,202
3,927
P
0,186
0,285
K
0,469
0,459
Na
11,044
13,704
Ca
1,202
4,905
Mg
2,909
2,913
Fe
0,033
0,017
Mn
0,115
0,115
Preparación del medio de la OCDE
Nutriente
Concentración en la solución madre
Solución madre 1:
macronutrientes
NH4Cl
1,5 g/l
MgCl2 · 6H2O
1,2 g/l
CaCl2 · 2H2O
1,8 g/l
MgSO4 · 7H2O
1,5 g/l
KH2PO4
0,16 g/l
Solución madre 2:
hierro
FeCl3 · 6H2O
64 mg/l
Na2EDTA · 2H2O
100 mg/l
Solución madre 3:
oligoelementos
H3BO3
185 mg/l
MnCl2 · 4H2O
415 mg/l
ZnCl2
3 mg/l
CoCl2 · 6H2O
1,5 mg/l
CuCl2 · 2H2O
0,01 mg/l
Na2MoO4 · 2H2O
7 mg/l
Solución madre 4:
bicarbonato
NaHCO3
50 g/l
Na2SiO3 · 9H20
Las soluciones madre se esterilizan mediante filtración por membrana (diámetro medio de poro 0,2 μm) o en autoclave (120 °C, 15 min). Las soluciones se guardan en la oscuridad a 4 °C.
Las soluciones madre 2 y 4 no deben esterilizarse en autoclave, sino mediante filtración por membrana.
El medio de cultivo se prepara añadiendo a agua un volumen adecuado de las soluciones madre 1 a 4:
A 500 ml de agua esterilizada se añaden:
10 ml de solución madre 1,
1 ml de solución madre 2,
1 ml de solución madre 3,
1 ml de solución madre 4,
Se enrasa a 1 000 ml con agua esterilizada.
Hay que dejar un tiempo suficiente para que el medio llegue al equilibrio con el CO2 de la atmósfera, en caso necesario burbujeando durante varias horas aire esterilizado por filtración.
Preparación del medio de la EPA de Estados Unidos
1.
Se añade 1 ml de cada solución madre de 2.1-2.7 a unos 900 ml de agua destilada o desionizada y después se diluye hasta 1 litro.
2.
Se preparan soluciones madre de macronutrientes disolviendo las siguientes sustancias en 500 ml de agua destilada o desionizada. Los reactivos 2.1, 2.2, 2.3 y 2.4 pueden combinarse en una única solución madre.
2.1.
NaNO3
12,750 g
2.2.
MgCl2 · 6H2O
6,082 g
2.3.
CaCl2 · 2H2O
2,205 g
2.4.
Solución madre de micronutrientes (véase 3).
2.5.
MgSO4 · 7H2O
7,350 g
2.6.
K2HPO4
0,522 g
2.7.
NaHCO3
7,500 g
2.8.
Na2SiO3 · 9H20
Véase la nota 1.
Nota 1: Utilícese solo para el ensayo con especies de diatomeas. Puede añadirse directamente (202,4 mg) o en forma de solución madre para dar una concentración final de Si en el medio de 20 mg/l.
3.
La solución madre de micronutrientes se prepara disolviendo las siguientes sustancias en 500 ml de agua destilada o desionizada:
3.1.
H3BO3
92,760 mg
3.2.
MnCl2 · 4H2O
207,690 mg
3.3.
ZnCl2
1,635 mg
3.4.
FeCl3 · 6H2O
79,880 mg
3.5.
CoCl2 · 6H2O
0,714 mg
3.6.
CaCl4 · 2H2O
3,630 mg
3.7.
CuCl2 · 2H2O
0,006 mg
3.8.
Na2EDTA · 2H2O
150,000 mg [ (etilendinitrilo)tetraacetato de disodio].
3.9.
Na2SeO4 · 5H2O
0,005 mg. Véase la nota 2.
Nota 2: Utilícese solo en el medio para los cultivos madre de especies de diatomeas.
4.
Se ajusta el pH a 7,5 ± 0,1 con NaOH o HCl 0,1 N o 1,0 N.
5.
Se pasan los medios a un recipiente estéril a través de un filtro de membrana de 0,22 μm si se va a utilizar un contador de partículas o de un filtro de 0,45 μm en caso contrario.
6.
Los medios se guardan en la oscuridad a unos 4 °C hasta que se vayan a utilizar.
Apéndice 4
Ejemplo de procedimiento para el cultivo de algas
Observaciones generales
El objetivo del cultivo mediante el siguiente procedimiento es el de obtener cultivos de algas para ensayos de toxicidad.
Utilícense métodos apropiados que garanticen que los cultivos de algas no están infectados con bacterias. Puede ser conveniente utilizar cultivos axénicos, pero se deben obtener y utilizar cultivos procedentes de una sola célula de alga.
Todas las operaciones deben llevarse a cabo en condiciones estériles, con el fin de evitar la contaminación con bacterias u otras algas.
Equipo y material
Véase el epígrafe “Equipo” del método de ensayo.
Procedimiento para la obtención de algas
Preparación de soluciones nutritivas (medios)
Todas las sales nutrientes del medio se preparan como soluciones madre concentradas y se mantienen en lugar fresco y oscuro. Estas soluciones se esterilizan por filtración o en autoclave.
El medio se prepara añadiendo a agua destilada estéril la cantidad correcta de solución madre, teniendo cuidado de que no se produzca ninguna contaminación. Para conseguir un medio sólido se añade un 0,8 % de agar.
Cultivos madre
Los cultivos madre son pequeños cultivos de algas que se trasfieren periódicamente a un medio fresco para hacer de material inicial del ensayo. Si los cultivos no se utilizan regularmente, se extienden en tubos de agar inclinado. Estos cultivos se transfieren a medio fresco al menos cada dos meses.
Los cultivos madre se cultivan en matraces Erlenmeyer que contienen un volumen de unos 100 ml de medio apropiado. Cuando las algas se incuban a 20 °C con iluminación continua, será necesario hacer una transferencia semanal.
En este pase se transfiere una cantidad del cultivo “viejo” con pipetas estériles a un matraz de medio fresco, de forma que la concentración inicial en caso de una especie de rápido crecimiento sea unas 100 veces menor que en el cultivo viejo.
La tasa de crecimiento de una especie puede determinarse a partir de la curva de crecimiento. Si se conoce, será posible calcular la densidad a la cual deberá transferirse el cultivo al medio nuevo. Esto deberá realizarse antes de que el cultivo alcance su fase letal.
Precultivo
El objetivo del precultivo es obtener una cantidad apropiada de algas para la inoculación de los cultivos de ensayo. Dicho precultivo debe incubarse en las condiciones del ensayo y utilizarse cuando esté aún en fase de crecimiento exponencial, normalmente después de un período de incubación de 2 a 4 días. Si los cultivos de algas contienen células deformadas o anormales, deberán eliminarse.
Apéndice 5
Análisis de datos por regresión no lineal
Consideraciones generales
La respuesta en los ensayos con algas y otros ensayos de crecimiento microbiano (incremento de biomasa) es por su naturaleza una variable continua o métrica: la tasa de un proceso si se utiliza la tasa de crecimiento, o su integral a lo largo del tiempo si se elige la biomasa. Ambas tienen como referencia la respuesta promedio correspondiente de unos controles no expuestos, en réplicas paralelas, que muestran una respuesta máxima en las condiciones aplicadas, siendo la luz y la temperatura los principales factores que influyen en el ensayo de las algas. El sistema es distribuido u homogéneo y la biomasa puede considerarse como un continuo sin tener en cuenta las células en sí. La distribución de la varianza del tipo de respuesta de un sistema de estas características depende solo de los factores experimentales (lo que se describe típicamente con una distribución de errores normal o logarítmico-normal). Esto contrasta con las respuestas típicas de bioensayos con datos cuánticos, respecto a los cuales se supone con frecuencia que el componente dominante de la varianza es la tolerancia (con una distribución típicamente binomial) de cada uno de los organismos. Las respuestas del control en este caso son nulas o están a nivel de fondo.
En la situación sin complicación, la respuesta normalizada o relativa, r, disminuye de forma monótona desde 1 (inhibición nula) hasta 0 (inhibición del 100 %). Obsérvese que todas las respuestas tienen un error asociado, y que es posible calcular inhibiciones negativas aparentes solo como resultado de errores aleatorios.
Análisis de regresión
Modelos:
El objeto de un análisis de regresión es describir cuantitativamente la curva concentración-respuesta en forma de una función de regresión matemática Y = f (C) o, más frecuentemente, F (Z), donde Z = log C. De forma inversa C = f– 1 (Y) permite calcular valores de ECx, como las EC50, EC10 y EC20, y sus límites de confianza del 95 %. Se ha visto que algunas funciones matemáticas simples describen bien las relaciones concentración-respuesta obtenidas en los ensayos de inhibición del crecimiento de las algas. Entre estas funciones figuran, por ejemplo, la ecuación logística, la ecuación asimétrica de Weibull y la función de distribución logarítmico-normal, todas las cuales son curvas sigmoideas que se aproximan asintóticamente a cero cuando C → 0, y a uno cuando C → infinito.
Recientemente se ha propuesto el uso de modelos de función de umbral continua (por ejemplo, el modelo de Kooijman “de inhibición del crecimiento de la población”, Kooijman et al., 1996) como alternativa a los modelos asintóticos Este modelo supone que no hay efectos a concentraciones por debajo de cierto umbral, EC0+, que se estima mediante extrapolación de la relación concentración-respuesta hasta su intersección con el eje de las concentraciones utilizando una función continua simple que no es diferenciable en el punto inicial.
Obsérvese que el análisis puede ser una simple minimización de las sumas de los cuadrados residuales (suponiendo una varianza constante) o cuadrados ponderados si se compensa la heterogeneidad de la varianza.
Procedimiento
El procedimiento puede describirse de la manera siguiente. Se selecciona una ecuación funcional apropiada, Y = f (C), y se ajusta a los datos mediante regresión no lineal. Es mejor utilizar las mediciones de cada matraz en lugar de los promedios de las réplicas, a fin de obtener de los datos el máximo de información posible. Por otra parte, si la varianza es alta, la experiencia práctica sugiere que los valores promedios de las réplicas pueden dar una estimación matemática más sólida, menos influida por los errores sistemáticos de los datos, que si se atiende a cada uno de los puntos de datos.
Se representan la curva ajustada y los datos medidos, y se examina si es adecuado el ajuste de la curva. El análisis de los valores residuales puede ser una herramienta muy útil a este respecto. Si la relación funcional elegida para ajustar la relación concentración-respuesta no describe bien toda la curva o alguna parte fundamental de ella, como la respuesta a concentraciones bajas, debe elegirse otra opción de ajuste de la curva como, por ejemplo, una curva asimétrica del tipo de la función de Weibull, en lugar de una simétrica. Las inhibiciones negativas pueden ser un problema, por ejemplo con la función de distribución logarítmico-normal, y también en este caso ha de aplicarse otra función de regresión. No se recomienda asignar un valor cero ni uno positivo pequeño a tales valores negativos porque así se distorsiona la distribución del error. Puede ser adecuado hacer ajustes distintos en partes de la curva tales como la de inhibición baja para calcular ECx con bajos valores de x. A partir de la ecuación ajustada se calculan [por “estimación inversa”, C = f– 1 (Y)] unas estimaciones de varias ECx en puntos característicos y se comunican como mínimo las estimaciones de EC50 y de una o dos ECx con x bajo. La experiencia en la práctica demuestra que la precisión del ensayo de las algas suele permitir una estimación razonablemente exacta del nivel de inhibición del 10 % si hay suficientes puntos de datos, salvo que haya estimulación a bajas concentraciones, lo que sería un factor de confusión. La precisión de una estimación de EC20 suele ser bastante mejor que la de una EC10, porque la EC20 suele corresponder a la parte aproximadamente lineal del centro de la curva concentración-respuesta. A veces es difícil interpretar la EC10 debido a una estimulación del crecimiento. Así pues, aunque la EC10 se puede obtener normalmente con suficiente exactitud, se recomienda asimismo indicar siempre la EC20.
Factores de ponderación
La varianza experimental no es constante en general e incluye típicamente un componente proporcional, por lo que es mejor efectuar sistemáticamente una regresión ponderada. Se acepta normalmente que los factores de ponderación de un análisis de este tipo son inversamente proporcionales a la varianza:
Wi = 1/Var (ri)
Muchos programas de regresión permiten la opción de hacer un análisis de regresión ponderada con los factores de ponderación incluidos en un cuadro. Es conveniente normalizar los factores de ponderación multiplicándolos por n/Σ wi (n es el número de puntos de datos) de forma que su suma sea igual a uno.
Respuestas de normalización
La normalización por la respuesta promedio de control plantea varios problemas de principio y ocasiona una estructura de varianza bastante compleja. Al dividir las respuestas por la respuesta promedio del control para obtener el porcentaje de inhibición, se introduce un error más debido al error del promedio del control. Salvo que este error sea despreciable, es necesario corregir los factores de ponderación de la regresión y los límites de confianza para tener en cuenta la covarianza con el control (Draper y Smith, 1981). Obsérvese que es importante una elevada precisión del promedio estimado de la respuesta del control a fin de minimizar la varianza general de la respuesta relativa. La varianza se indica a continuación:
(el subíndice i se refiere al nivel de concentración i y el subíndice 0 a los controles)
Yi = Respuesta relativa = ri/r0 = 1 – I = f (Ci)
con una varianza Var (Y i) = Var ( ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri)2 · Var (ri) + ( (∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var (r0)
y como (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 y (∂ Y i/ ∂ r0) = ri/r0 2
con una distribución normal de los datos y las réplicas mi y m0: Var (ri ) = σ2/mi
la varianza total de la respuesta relativa, Yi, se convierte entonces en:
Var (Yi) = σ2/ (r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0
El error en el promedio del control es inversamente proporcional a la raíz cuadrada del número de réplicas del control contabilizadas para la media, y a veces se puede justificar la inclusión de datos de antecedentes y, así, reducir mucho el error. Otra posibilidad consiste en no normalizar los datos y ajustar las respuestas absolutas, con inclusión de los datos de la respuesta del control, pero introduciendo el valor de la respuesta del control como parámetro adicional que debe ajustarse con regresión no lineal. Con una ecuación usual de regresión de 2 parámetros, este método necesita el ajuste de 3 parámetros, por lo que exige más puntos de datos que la regresión no lineal de datos que se normalizan mediante una respuesta del control preestablecida.
Intervalos de confianza inversos
El cálculo de intervalos de confianza de regresión no lineal por estimación inversa es bastante complejo y no es una opción frecuentemente disponible en los paquetes normales de programas informáticos de estadística. Pueden obtenerse unos límites de confianza aproximados con programas normales de regresión no lineal con reparametrización (Bruce y Versteeg, 1992), lo que implica reescribir la ecuación matemática con las estimaciones de los puntos deseados, por ejemplo, la EC10 y la EC50 como parámetros que deben estimarse. [Sea la función I = f (α, β, concentración) y utilícense las relaciones de la definición f (α, β, EC10) = 0,1 y f (α, β, EC50) = 0,5 para sustituir f (α, β, concentración) por una función equivalente g (EC10, EC50, concentración.]
Se realiza un cálculo más directo (Andersen et al., 1998) manteniendo la ecuación original y utilizando un desarrollo de Taylor en torno a los promedios de ri y r0.
Últimamente se han popularizado los “métodos de remuestreo” (bootstrap). Tales métodos utilizan los datos medidos y un remuestreo frecuente dirigido por un generador de números aleatorios para calcular una distribución empírica de la varianza.
BIBLIOGRAFÍA
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.
Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, Nueva York.
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.
»
4)
El capítulo C.11 se sustituye por el texto siguiente:
«
C. 11. LODO ACTIVADO: PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA RESPIRACIÓN (OXIDACIÓN DE CARBONO Y DE AMONIO)
INTRODUCCIÓN
1.
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 209 (2010). El presente método de ensayo describe un método para determinar los efectos de una sustancia sobre los microorganismos del lodo activado (en gran medida, bacterias) midiendo su tasa de respiración (oxidación de carbono o de amonio) en unas condiciones determinadas y en presencia de concentraciones diferentes de la sustancia problema. El método se basa en el ensayo de la ETAD (asociación ecológica y toxicológica de fabricantes de colorantes) (1) (2), en la versión anterior de las directrices de ensayo de la OCDE TG 209 (3) y en la norma ISO 8192 revisada (4). El objetivo de este ensayo consiste en establecer un método de cribado rápido para evaluar los efectos de las sustancias sobre los microorganismos del lodo activado de la fase biológica (aerobia) de las plantas de tratamiento de aguas residuales. Los resultados de este ensayo podrán servir también como indicador de las concentraciones no inhibitorias apropiadas de las sustancias problema que hayan de utilizarse en las pruebas de biodegradabilidad (por ejemplo, los capítulos C.4 A-F, C.9, C.10, C.12 y C. 29 del presente anexo, OCDE TG 302C). En este caso, el ensayo puede realizarse como ensayo de cribado, similar a un ensayo de determinación del intervalo o un ensayo límite (véase el punto 39), teniendo en cuenta solamente el conjunto de la respiración. Sin embargo, esta información debe tomarse con precaución en relación con los ensayos de la biodegradabilidad fácil (capítulos C.4 A-F y C.29 del presente anexo) en los que la concentración de inóculo es significativamente inferior a la utilizada en el presente método de ensayo. En efecto, la ausencia de inhibición en esta prueba de respiración no conduce automáticamente a unas condiciones no inhibitorias en el ensayo de biodegradabilidad fácil de los capítulos C.4 A-F o C.29 del presente anexo.
2.
En general, parece que el ensayo de inhibición de la respiración se ha aplicado con éxito desde su primera publicación, pero en algunas ocasiones se han notificado resultados engañosos, como, por ejemplo, en las referencias (2), (4) o (5). Las curvas de respiración en función de la concentración son a veces bifásicas, las gráficas dosis-respuesta se distorsionan y los valores de EC50 son inesperadamente bajos (5). Las investigaciones han puesto de manifiesto que estos resultados se obtienen cuando el lodo activado utilizado en el ensayo es fuertemente nitrificante y la sustancia problema tiene un impacto mayor en la oxidación del amonio que en la oxidación heterotrófica en general. Por lo tanto, estos resultados engañosos pueden superarse mediante la realización de ensayos adicionales con un inhibidor específico de la nitrificación. Por medición de las tasas de absorción de oxígeno en presencia y en ausencia de un inhibidor de este tipo como, por ejemplo, la N-aliltiourea (ATU), es posible calcular las distintas tasas de absorción de oxígeno total, heterotrófica y de nitrificación (4) (7) (8). Así pues, se pueden calcular los efectos inhibidores de una sustancia problema en los dos procesos y se pueden calcular de la forma habitual los valores de la EC50, en relación tanto con la oxidación (heterotrófica) del carbono orgánico como con la oxidación del amonio (nitrificación). Debe señalarse que, en algunos raros casos, el efecto inhibitorio de la N-aliltiourea puede ser parcial o totalmente anulado como consecuencia de la complejación con sustancias problema o suplementos del medio como, por ejemplo, iones Cu++ (6). Los iones Cu++ son esenciales para Nitrosomonas, pero son tóxicos a concentración superior.
3.
Se ha hecho urgente, sobre todo en los países europeos, la necesidad de la nitrificación en el tratamiento aeróbico de las aguas residuales, como paso necesario en el proceso de eliminación de los compuestos nitrogenados de las aguas residuales por desnitrificación para formar productos gaseosos; ahora, la UE ha fijado límites más bajos para la concentración de nitrógeno en los efluentes tratados vertidos a las aguas receptoras (5).
4.
Para la mayoría de los fines, es adecuado utilizar el método para evaluar el efecto solo sobre los procesos de oxidación de carbono orgánico. No obstante, para la interpretación de los resultados y la comprensión de los efectos es necesario en algunos casos un examen del efecto solo sobre la nitrificación o sobre tanto la nitrificación como la oxidación del carbono orgánico por separado.
PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO
5.
Las tasas de respiración de las muestras de lodo activado alimentado con agua residual sintética se miden en una celda cerrada que contiene un electrodo de oxígeno después de un tiempo de contacto de 3 horas. Teniendo en cuenta el escenario realista de exposición, podrían ser adecuados unos tiempos de contacto más prolongados. Si la sustancia problema se degrada rápidamente mediante hidrólisis abiótica, por ejemplo, o es volátil y la concentración no puede mantenerse adecuadamente, puede utilizarse además un período de exposición más corto, por ejemplo de 30 minutos. La sensibilidad de cada lote de lodo activado debe comprobarse el día de la exposición con una sustancia de referencia apropiada. El ensayo se utiliza típicamente para determinar la ECx (p. ej., la EC50) de la sustancia problema o la concentración sin efecto observado (NOEC).
6.
La inhibición de la absorción de oxígeno por microorganismos que oxidan el carbono orgánico puede expresarse aparte de la correspondiente a los microorganismos que oxidan el amonio, a través de mediciones de las tasas de absorción de oxígeno en ausencia y en presencia de N-aliltiourea, que es un inhibidor específico de la oxidación del amonio a nitrito por las bacterias nitrificantes de la primera fase. En este caso, el porcentaje de inhibición de la tasa de absorción de oxígeno se calcula mediante comparación de la tasa de absorción de oxígeno en presencia de la sustancia problema con la tasa media de absorción de oxígeno de los correspondientes controles sin sustancia problema, en ambas ocasiones tanto en presencia como en ausencia del inhibidor específico, la N-aliltiourea.
7.
La eventual absorción de oxígeno debida a procesos abióticos puede detectarse mediante la determinación de la tasa en mezclas de sustancia problema, medio de agua residual sintética y agua, prescindiendo del lodo activado.
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA
8.
Para poder interpretar correctamente los resultados, es necesario conocer la identidad (de preferencia, el número CAS), el nombre (IUPAC) y las características de pureza, hidrosolubilidad, presión de vapor, volatilidad y adsorción de la sustancia problema. Normalmente no es posible hacer el ensayo de manera adecuada con sustancias volátiles, salvo que se adopten precauciones especiales (véase el punto 21).
APLICABILIDAD DEL MÉTODO DE ENSAYO
9.
El método de ensayo puede aplicarse a sustancias hidrosolubles, poco solubles y volátiles. Sin embargo, puede que no siempre sea posible obtener valores de EC50 con sustancias de solubilidad limitada, y solo pueden obtenerse resultados válidos con sustancias volátiles si la mayor parte (por ejemplo, > 80 %) de la sustancia problema permanece en la mezcla de reacción al final del período o períodos de exposición. Deben presentarse datos analíticos adicionales de apoyo para afinar la concentración ECx cuando exista incertidumbre acerca de la estabilidad de la sustancia problema o de su volatilidad.
SUSTANCIAS DE REFERENCIA
10.
Deben someterse al ensayo periódicamente sustancias de referencia, con el fin de garantizar que son fiables el método de ensayo y las condiciones de ensayo, y para comprobar la sensibilidad de cada lote de lodo activado utilizado como inóculo microbiano el día de la exposición. Se recomienda como sustancia inhibidora de referencia el 3,5-diclorofenol (3,5-DCP) puesto que es un conocido inhibidor de la respiración y se utiliza en numerosos tipos de ensayo de inhibición/toxicidad (4). Asimismo, puede utilizarse el sulfato de cobre (II) pentahidratado como sustancia de referencia para la inhibición de la respiración total (9). La N-metilanilina puede utilizarse como inhibidor específico de referencia de la nitrificación (4).
CRITERIOS DE VALIDEZ Y REPRODUCIBILIDAD
11.
La tasa de consumo de oxígeno de los controles en blanco (sin la sustancia problema ni la sustancia de referencia) no debe ser inferior a 20 mg de oxígeno por gramo de lodo activado (peso seco de los sólidos en suspensión) en una hora. Si la tasa es inferior, debe repetirse el ensayo con lodo activado lavado o con lodo de otra fuente. El coeficiente de variación de la tasa de absorción de oxígeno en las réplicas de los controles no debe ser superior al 30 % al final del ensayo definitivo.
12.
En un ensayo interlaboratorios internacional de 2004, organizado por la ISO (4) con fangos activados procedentes de aguas residuales domésticas, se observó que la EC50 del 3,5-DCP se halla en el intervalo de 2 mg/l a 25 mg/l para la respiración total, de 5 mg/l a 40 mg/l para la respiración heterotrófica y de 0,1 mg/l a 10 mg/l para la respiración de nitrificación. Si la EC50 del 3,5-DCP no está en el intervalo esperado, hay que repetir el ensayo con lodo activado procedente de otra fuente. La EC50 del sulfato de cobre (II) pentahidratado debe situarse en el intervalo de 53- 155 mg/l para la respiración total (9).
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO
Recipientes y equipo del ensayo
13.
Se utilizará material habitual de laboratorio, además de lo siguiente:
a)
recipientes de ensayo como, por ejemplo, vasos de 1 000 ml que contengan 500 ml de la mezcla de reacción (véase 5 en la figura 1);
b)
celda y accesorios para medir la concentración de oxígeno disuelto, un electrodo de oxígeno adecuado, una celda cerrada para contener la muestra sin espacio libre y un registrador (por ejemplo, 7, 8, 9 en la figura 1 del apéndice 2); otra posibilidad es utilizar un frasco de DBO con un adaptador de manguito adecuado para sellar el electrodo de oxígeno con el cuello del frasco (véase la figura 2 del apéndice 3); a fin de evitar la pérdida de líquido desplazado cuando se inserte el electrodo de oxígeno, es aconsejable introducir primero un embudo o tubo de vidrio a través del manguito, o utilizar recipientes de bordes ensanchados; en ambos casos debe utilizarse un agitador magnético u otro método de agitación como, por ejemplo, una sonda de agitación propia;
c)
agitadores magnéticos con sus barritas, revestidas de material inerte, para su uso en la cámara de medición o en los recipientes de ensayo;
d)
dispositivo de aireación: en caso necesario, debe pasarse aire comprimido a través de un filtro adecuado, para eliminar el polvo y el aceite, y a través de frascos de lavado con agua para humidificarlo; el contenido de los recipientes debe airearse con pipetas Pasteur, u otros dispositivos de aireación que no adsorban las sustancias; puede utilizarse un agitador orbital a una velocidad de entre 150 y 250 rpm con frascos de, por ejemplo, 2 000 ml de capacidad, para satisfacer la demanda de oxígeno del lodo y superar las dificultades planteadas por las sustancias que producen espuma excesiva, que son volátiles y, por lo tanto, se pierden, o que son difíciles de dispersar cuando se airean por corriente de aire; el sistema de ensayo es, por lo general, una serie de vasos aireados permanentemente, establecidos de forma secuencial (por ejemplo, a intervalos de unos 10 o 15 minutos), y analizados después de manera secuencial; también puede utilizarse instrumentación validada que permita simultáneamente la aireación y la medición de la tasa de absorción de oxígeno en las mezclas;
e)
pH-metro;
f)
centrifugadora general de sobremesa para lodo, capaz de funcionar a 10 000 m/s2.
Reactivos
14.
Deben utilizarse siempre reactivos de grado analítico.
Agua
15.
Debe utilizarse agua destilada o desionizada, con menos de 1 mg/l de COD, salvo en caso de que se especifique agua del grifo exenta de cloro.
Agua residual sintética
16.
El medio debe prepararse de forma que contenga los siguientes componentes en las cantidades indicadas:
—
peptona
16 g
—
extracto de carne (o extracto vegetal comparable)
11 g
—
urea
3 g
—
cloruro de sodio (NaCl)
0,7 g
—
cloruro de calcio dihidratado (CaC12 · 2H2O)
0,4 g
—
sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 · 7H2O)
0,2 g
—
monohidrogenofosfato de potasio anhidro (K2HPO4)
2,8 g
—
agua destilada o desionizada hasta enrasar a 1 litro.
17.
El pH de esta solución debe ser 7,5 ± 0,5. Si el medio así preparado no va a utilizarse inmediatamente, debe conservarse en la oscuridad y a una temperatura de 0 a 4 °C, durante una semana como máximo, o en condiciones que no cambien su composición. Ha de tenerse en cuenta que esta agua residual sintética está 100 veces más concentrada que la descrita en el Informe Técnico de la OCDE, “Método propuesto para la determinación de la biodegradabilidad de los tensioactivos utilizados en los detergentes sintéticos” de 11 de junio de 1976; además se le ha añadido hidrogenofosfato dipotásico.
18.
Otra posibilidad es esterilizar los distintos componentes por separado, antes de su almacenamiento, o añadir la peptona y el extracto de carne poco antes de efectuar el ensayo. Antes de su utilización, el medio debe homogeneizarse bien y el pH ajustarse en caso necesario a un valor de 7,5 ± 0,5.
Sustancia problema
19.
En el caso de las sustancias problema fácilmente hidrosolubles, debe prepararse una solución madre solo hasta el límite de solubilidad (no es aceptable la presencia de precipitado). Las sustancias poco hidrosolubles, las mezclas con componentes de diferentes hidrosolubilidades y las sustancias adsorbentes deben pesarse directamente en los recipientes de ensayo. En estos casos, el uso de soluciones madre puede ser una alternativa si se determinan analíticamente en los recipientes de ensayo las concentraciones disueltas de las sustancias problema (antes de la adición de lodo activado). Si se preparan fracciones acomodadas en agua (WAF), es también esencial una determinación analítica de la concentración disuelta de las sustancias problema en los recipientes de ensayo. Debe evitarse recurrir a disolventes orgánicos, emulgentes o dispersantes para mejorar la solubilidad. Es posible aplicar ultrasonidos a las soluciones madre y someter las suspensiones a una agitación previa, por ejemplo durante la noche, cuando se disponga de información adecuada sobre la estabilidad de la sustancia problema en tales condiciones.
20.
La sustancia problema puede afectar negativamente al pH del sistema de ensayo. El pH de las mezclas tratadas con la sustancia problema debe determinarse antes de la prueba, en un ensayo preliminar, para determinar si es necesario un ajuste del pH antes de la prueba principal, y de nuevo el día de la prueba principal. Las soluciones o suspensiones de la sustancia problema en el agua deben neutralizarse antes de la adición del inóculo, si fuera necesario. No obstante, dado que la neutralización puede modificar las propiedades químicas de la sustancia, pueden efectuarse otros ensayos, en función de los objetivos del estudio, para evaluar el efecto de la sustancia problema sobre el lodo sin ajuste del pH.
21.
Los efectos tóxicos de las sustancias volátiles, especialmente en ensayos en los que se burbujea aire a través del sistema, pueden dar lugar a niveles de efectos variables debido a pérdidas de la sustancia durante el período de exposición. Hay que tener cuidado con tales sustancias realizando análisis específicos de ellas en mezclas de control que las contengan y modificando el régimen de aireación.
Sustancia de referencia
22.
Si se utiliza como sustancia de referencia el 3,5-diclorofenol, debe prepararse una solución de 1,00 g de 3,5-diclorofenol en 1 000 ml de agua (15). Para acelerar la disolución se debe utilizar agua caliente o aplicar ultrasonidos; se lleva al volumen final una vez se haya enfriado a temperatura ambiente. Sin embargo, debe garantizarse que la sustancia de referencia no se modifica estructuralmente. El pH de la solución debe comprobarse y, en caso necesario, ajustarse con NaOH o H2SO4 a un pH de 7 — 8.
23.
Si se utiliza como sustancia de referencia el sulfato de cobre (II) pentahidratado, se emplean las concentraciones de 58 mg/l, 100 mg/l y 180 mg/l (factor de 1,8). La sustancia se pesa directamente en los recipientes de ensayo (29 - 50 - 90 mg para 500 ml de volumen total). A continuación se disuelve con 234 ml de agua del grifo tratada en autoclave. El sulfato de cobre (II) pentahidratado es fácilmente soluble. Cuando se inicia el ensayo, se añaden 16 ml de agua residual sintética y 250 ml de lodo activado.
Inhibidor específico de la nitrificación
24.
Debe prepararse una solución madre de 2,32 g/l de N-aliltiourea (ATU). La adición de 2,5 ml de esta solución madre a una mezcla de incubación de 500 ml de volumen final da lugar a una concentración final de 11,6 mg de ATU/l (10– 4 mol/l), de la que se sabe (4) que es suficiente para causar una inhibición del 100 % de la nitrificación en un lodo activado nitrificante que contenga 1,5 g/l de sólidos suspendidos.
Control abiótico
25.
En algunas circunstancias poco frecuentes, una sustancia problema con fuertes propiedades reductoras puede provocar un consumo abiótico mensurable de oxígeno. En tales casos, es necesario contar con controles abióticos para discriminar entre absorción abiótica de oxígeno por la sustancia problema y respiración microbiana. Los controles abióticos pueden prepararse omitiendo el inóculo de las mezclas de ensayo. Del mismo modo, pueden incluirse controles abióticos sin inóculo cuando se llevan a cabo mediciones analíticas de apoyo para determinar la concentración obtenida durante la fase de exposición del ensayo, por ejemplo en caso de utilización de soluciones madre de sustancias poco hidrosolubles con componentes con diferente hidrosolubilidad. En casos concretos, puede ser necesario preparar un control abiótico con inóculo esterilizado (por ejemplo, mediante tratamiento en autoclave o añadiendo sustancias tóxicas esterilizadoras). Algunas sustancias pueden producir o consumir oxígeno solo si la superficie es lo suficientemente grande para reaccionar, incluso aunque en general necesiten una presión o temperatura mucho más elevada para hacerlo. A este respecto debe prestarse especial atención a los peróxidos. Un inóculo esterilizado ofrece una gran superficie.
Inóculo
26.
Para el uso general, debe recogerse lodo activado a la salida del tanque de aireación, o cerca de la salida del tanque, de una planta de tratamiento de aguas residuales con funcionamiento adecuado alimentada predominantemente con aguas residuales domésticas. En función del objetivo del ensayo, pueden ser adecuados también otros tipos de lodo activado como, por ejemplo, lodo cultivado en el laboratorio, con unas concentraciones adecuadas de sólidos en suspensión (de 2 a 4 g/l). Sin embargo, es probable que los lodos procedentes de distintas plantas de tratamiento presenten distintas características y sensibilidades.
27.
El lodo puede utilizarse tal como se recoge, pero deben retirarse las partículas gruesas dejando sedimentar un poco tiempo, por ejemplo de 5 a 15 minutos, y decantando la capa superior de sólidos más finos, o tamizando (p. ej., con una luz de malla de 1 mm2). Otra alternativa es homogeneizar el lodo en un mezclador durante al menos 15 segundos, pero hay que prestar atención a las fuerzas de cizalla y al cambio de temperatura que pueden producirse si dura mucho la operación de mezclado.
28.
A menudo es necesario lavar el lodo como, por ejemplo, cuando es baja la tasa de respiración endógena. En primer lugar, el lodo debe centrifugarse durante un tiempo para producir un sobrenadante claro y un precipitado de sólidos de agua residual, por ejemplo 10 minutos a aproximadamente 10 000 m/s2. El líquido sobrenadante debe desecharse y el lodo se vuelve a suspender en agua del grifo sin cloro, con agitación, y esta agua de lavado se elimina después volviendo a centrifugar y desechándola de nuevo. El proceso de lavado y centrifugado debe repetirse en caso necesario. Debe determinarse la masa seca de un volumen conocido de lodo resuspendido, y el lodo se concentra eliminando líquido o bien se diluye más en agua del grifo sin cloro, según sea necesario para obtener la concentración requerida de sólidos en el lodo, de 3 g/l. El lodo activado debe airearse continuamente (p. ej., 2 l/min) a la temperatura del ensayo y, cuando sea posible, utilizarse el mismo día de su recogida. Si esto no es posible, el lodo debe alimentarse diariamente con el agua residual sintética (50 ml de agua residual sintética por litro de lodo activado) durante dos días adicionales. El lodo se utiliza a continuación para el ensayo y los resultados se aceptan como válidos, a condición de que no se produzca ningún cambio significativo en su actividad, evaluada por su tasa de respiración endógena heterotrófica y de nitrificación.
29.
Pueden surgir dificultades si se forma espuma durante la incubación hasta el punto de que la espuma y los sólidos del lodo en ella transportados salen de los recipientes de aireación. En ocasiones, la formación de espuma puede resultar simplemente de la presencia de agua residual sintética, pero debe contarse con esta formación de espuma si la sustancia problema es, o contiene, un tensioactivo. La pérdida de sólidos del lodo de las mezclas de ensayo tendrá como resultado unas tasas de respiración reducidas artificialmente, que podrían interpretarse indebidamente como debidas a la inhibición. Además, la aireación de la solución del tensioactivo concentra a este en la capa de espuma; la pérdida de espuma del sistema de ensayo conducirá a una disminución de las concentraciones de exposición. La formación de espuma puede controlarse mediante métodos mecánicos simples (por ejemplo, agitación manual esporádica con una varilla de vidrio) o mediante la adición de un agente antiespumante en emulsión de silicona exenta de tensioactivos, y/o utilizando el método de aireación en frascos de agitación. Si el problema está asociado con la presencia del agua residual sintética, la composición de esta puede modificarse con la inclusión de un agente antiespumante en la proporción de, p. ej., 50 μl/l. Si la espuma se debe a la sustancia problema, hay que determinar la cantidad necesaria para su supresión a la concentración máxima de ensayo, y a continuación hay que tratar todos los distintos recipientes de aireación de la misma manera (incluidos también los controles en blanco y los recipientes de referencia en los que no hay espuma). Si se emplean agentes antiespumantes, no debería producirse ninguna interacción con el inóculo ni con la sustancia problema.
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
30.
Puede determinarse la inhibición de tres absorciones de oxígeno diferentes: la total, la solo heterotrófica y la debida a la nitrificación. Normalmente debe ser adecuada la medición de la inhibición de la absorción total de oxígeno. Es necesario determinar los efectos sobre la absorción heterotrófica de oxígeno debida a la oxidación del carbono orgánico, y sobre la debida a la oxidación del amonio cuando exista un requisito específico de estos dos parámetros por separado en relación con una sustancia particular, o (de forma optativa) para explicar las eventuales curvas dosis-respuesta atípicas obtenidas en el estudio de la inhibición de la absorción total de oxígeno.
Condiciones de ensayo
31.
El ensayo debe realizarse a la temperatura de 20 ± 2 °C.
Mezclas de ensayo
32.
Deben prepararse mezclas de ensayo (indicadas como FT en el cuadro 1) con agua, agua residual sintética y la sustancia problema para obtener diferentes concentraciones nominales de la sustancia problema (véanse en el cuadro 1 ejemplos de volúmenes de los componentes). Hay que ajustar el pH a 7,5 ± 0,5, si es necesario; las mezclas deben diluirse con agua y se añade el inóculo para obtener el mismo volumen final en los recipientes y comenzar la aireación.
Mezclas de referencia
33.
Deben prepararse mezclas (FR) con la sustancia de referencia, por ejemplo, 3,5-diclorofenol, en lugar de la sustancia problema, de la misma manera que las mezclas de ensayo.
Controles en blanco
34.
Deben prepararse controles en blanco (FB) al comienzo y al final del período de exposición en ensayos en los que se establecen los vasos del ensayo secuencialmente a intervalos. En los ensayos efectuados con equipo que permita la medición simultánea del consumo de oxígeno, se deben incluir al menos dos controles en blanco en cada lote de análisis simultáneo. Los controles en blanco contienen volúmenes iguales de lodo activado y de medio sintético, pero no tienen sustancia problema ni sustancia de referencia. Deben diluirse con agua hasta el mismo volumen que las mezclas de ensayo y de referencia.
Control abiótico
35.
En caso necesario, por ejemplo si se sabe o sospecha que la sustancia problema presenta propiedades reductoras fuertes, debe prepararse una mezcla FA para medir el consumo abiótico de oxígeno. La mezcla debe tener las mismas cantidades de sustancia problema y de agua residual sintética, y el mismo volumen que las mezclas de ensayo, pero sin lodo activado.
Procedimiento general y mediciones
36.
Las mezclas de ensayo, las mezclas de referencia y los controles en blanco y abióticos se incuban a la temperatura de ensayo en condiciones de aireación forzada (de 0,5 a 1 l/min) para mantener la concentración de oxígeno disuelto por encima del 60 — 70 % de la saturación y mantener en suspensión los flóculos de lodo. También es necesario agitar los cultivos para mantener en suspensión los flóculos de lodo. Se considera que la incubación empieza con el contacto inicial del inóculo de lodo activado con los demás componentes de la mezcla final. Al final de la incubación, después de los períodos de exposición especificados, que suelen ser de 3 horas, se toman muestras para medir la tasa de disminución de la concentración de oxígeno disuelto en la celda diseñada a tal fin (figura 2 del apéndice 3) o en un frasco de DBO completamente lleno. La manera de empezar la incubación también depende de la capacidad del equipo empleado para medir las tasas de consumo del oxígeno. Por ejemplo, en el caso de que comprenda una única sonda de oxígeno, las mediciones se efectuarán de forma individual. En este caso, deben prepararse las diversas mezclas necesarias para el ensayo con agua residual sintética pero sin el inóculo, y a cada recipiente de la serie se le añaden las cantidades necesarias de lodo. Las incubaciones deben iniciarse por turnos, a intervalos establecidos de forma conveniente, por ejemplo de 10 a 15 minutos. Otra posibilidad es que el sistema de medición cuente con varias sondas que faciliten la realización de múltiples mediciones simultáneas; en este caso, el inóculo puede añadirse al mismo tiempo a los grupos pertinentes de recipientes.
37.
La concentración de lodo activado en todas las mezclas de ensayo, de referencia y en blanco (pero no en el control abiótico) es nominalmente de 1,5 g/l de sólidos en suspensión. El consumo de oxígeno debe medirse tras 3 horas de exposición. Deben efectuarse mediciones también tras una exposición de 30 minutos, cuando proceda y según se describe en el punto 5.
Potencial de nitrificación del lodo
38.
Con el fin de decidir si el lodo es nitrificante y, en caso afirmativo, a qué tasa, deben prepararse mezclas (FB) como la del control en blanco y otras mezclas de “control” (FN) que también contengan N-aliltiourea a la concentración de 11,6 mg/l. Las mezclas deben airearse e incubarse a 20° ± 2 °C durante 3 horas. A continuación, deben medirse las tasas de absorción de oxígeno y calcularse la tasa de absorción de oxígeno debida a la nitrificación.
Diseños del ensayo
Ensayo de determinación del intervalo
39.
Se utiliza un ensayo preliminar, cuando sea necesario, para hacer una estimación del intervalo de concentraciones de la sustancia problema necesario en un ensayo definitivo para determinar la inhibición del consumo de oxígeno. De manera alternativa, la inexistencia de inhibición del consumo de oxígeno por la sustancia problema en un ensayo preliminar puede demostrar que es innecesario un ensayo definitivo, pero debe estudiarse por triplicado la concentración de ensayo más elevada del ensayo preliminar (normalmente de 1 000 mg/l, aunque esto depende de los requisitos de datos).
Cuadro 1.
Ejemplos de mezclas del ensayo preliminar.
Reactivo
Concentración original
Solución madre de sustancia problema
10 g/l
Solución madre de medio sintético
Véase el punto 16.
Suspensión madre de lodo activado
3 g/l of suspended solids
Componentes de las mezclas
Dosificación en los recipientes de ensayo (6)
FT1
FT2
FT3-5
FB1-2
FA
Solución madre de sustancia problema (ml)
(puntos 19 a 21)
0,5
5
50
0
50
Solución madre de agua residual sintética (ml)
(punto 16).
16
16
16
16
16
Suspensión de lodo activado (ml)
(puntos 26 a 29)
250
250
250
250
0
Agua
(punto 15)
233,5
229
184
234
434
Volumen total de las mezclas (ml)
500
500
500
500
500
Concentrations in the mixture
Suspensión de ensayo (mg/l)
Lodo activado
10
100
1 000
0
1 000
(sólidos en suspensión) (mg/l)
1 500
1 500
1 500
1 500
0
40.
El ensayo se debe realizar utilizando un mínimo de tres concentraciones de la sustancia problema, por ejemplo de 10 mg/l, 100 mg/l y 1 000 mg/l, con un control en blanco y, en caso necesario, un mínimo de tres controles abióticos con las concentraciones más elevadas de la sustancia problema (véase, a título de ejemplo, el cuadro 1). Lo ideal es que la concentración más baja no tenga ningún efecto en el consumo de oxígeno. Deben calcularse las tasas de absorción de oxígeno y la tasa de nitrificación, en su caso; después debe calcularse el porcentaje de inhibición. Según el objetivo del ensayo, también es posible determinar simplemente la toxicidad de una concentración límite como, p. ej., 1 000 mg/l. Si a esta concentración no se dan efectos tóxicos estadísticamente significativos, no es necesario efectuar más ensayos a concentraciones más altas ni más bajas. Ha de señalarse que las sustancias poco hidrosolubles, las mezclas con componentes de diferentes hidrosolubilidades y las sustancias adsorbentes deben pesarse directamente en los recipientes de ensayo. En este caso, el volumen reservado para la solución madre de sustancia problema debe sustituirse con agua de dilución.
Ensayo definitivo
Inhibición de la absorción de oxígeno total
41.
El ensayo debe realizarse con un intervalo de concentraciones deducido del ensayo preliminar. A fin de obtener tanto una NOEC como una ECx (p. ej., EC50), se recomienda utilizar en la mayoría de los casos seis controles y cinco concentraciones de tratamiento en progresión geométrica, con cinco réplicas. El control abiótico no tiene que repetirse si no hay absorción de oxígeno en el ensayo preliminar, pero si se produce una absorción significativa deben incluirse controles abióticos con cada concentración de sustancia problema. La sensibilidad del lodo debe comprobarse utilizando la sustancia de referencia 3,5-diclorofenol. La sensibilidad del lodo debe comprobarse con cada serie de ensayos, ya que se sabe que la sensibilidad fluctúa. En todos los casos, se retiran muestras de los recipientes de ensayo después de 3 horas, y también después de 30 minutos en caso necesario, para medir la tasa de absorción de oxígeno en la celda del electrodo de oxígeno. A partir de los datos obtenidos, se calculan las tasas de respiración específicas del control y de las mezclas de ensayo; el porcentaje de inhibición se calcula a partir de la ecuación 7 que figura más abajo.
Diferenciación entre inhibición de la respiración heterotrófica y de la nitrificación
42.
La utilización del inhibidor específico de la nitrificación, la ATU, permite la evaluación directa de los efectos inhibidores de la sustancia problema sobre la oxidación heterotrófica y, restando la tasa de absorción de oxígeno en presencia de ATU de la tasa de absorción total (sin presencia de ATU), pueden calcularse los efectos sobre la tasa de nitrificación. Deben prepararse dos conjuntos de mezclas de reacción de acuerdo con los diseños del ensayo respecto a la CEx o la NOEC descritos en el punto 41, pero, además, debe añadirse ATU a cada mezcla de uno de los conjuntos a una concentración final de 11,6 mg/l, que se ha demostrado que inhibe completamente la nitrificación en lodos con unas concentraciones de sólidos en suspensión de hasta 3 000 mg/l (4). Las tasas de absorción de oxígeno deben medirse tras el período de exposición; estos valores directos representan solo la respiración heterotrófica, y las diferencias entre estos y las tasas de respiración total correspondientes representan la nitrificación. A partir de estos datos se calculan los diversos grados de inhibición.
Mediciones
43.
Tras el período o períodos de exposición, debe transferirse una muestra del primer recipiente de aireación a la celda del electrodo de oxígeno (figura 1 del apéndice 2) y debe medirse inmediatamente la concentración de oxígeno disuelto. Si se dispone de un sistema de electrodos múltiples, las mediciones podrán efectuarse simultáneamente. Es esencial agitar (mediante un imán recubierto) a la misma velocidad que cuando se calibra el electrodo para garantizar que la sonda responde con un retraso mínimo a la evolución de las concentraciones de oxígeno, y para permitir mediciones regulares y reproducibles del oxígeno en el recipiente de medición. Por lo general, es adecuado el sistema de sonda de agitación propia que tienen algunos electrodos de oxígeno. La celda debe lavarse con agua entre medición y medición. Como alternativa, puede utilizarse la muestra para llenar un frasco de DBO (figura 2 del apéndice 3) provisto de un agitador magnético. A continuación debe insertarse en el cuello del frasco una sonda de oxígeno con un adaptador de manguito y debe ponerse en funcionamiento el agitador magnético. En ambos casos, la concentración de oxígeno disuelto debe medirse de forma continua y registrarse durante un tiempo, generalmente de 5 a 10 minutos, o hasta que la concentración de oxígeno descienda por debajo de 2 mg/l. Se debe extraer el electrodo, devolver la mezcla al recipiente de aireación y continuar la aireación y agitación, si resulta necesario efectuar mediciones tras un tiempo de exposición más prolongado.
Verificación de la concentración de la sustancia problema
44.
En algunos casos puede ser necesario medir la concentración de la sustancia problema en los recipientes de ensayo. Hay que señalar que, si se utilizan soluciones madre de:
—
sustancias poco hidrosolubles,
—
mezclas con componentes con diferentes hidrosolubilidades, o
—
sustancias con buena hidrosolubilidad pero cuya concentración en la solución madre está cercana al máximo de hidrosolubilidad,
entonces no se conoce la fracción disuelta, y tampoco se conoce la concentración real de la sustancia problema que se transfiere a los recipientes de ensayo. Con el fin de caracterizar la exposición, es necesaria una estimación analítica de las concentraciones de la sustancia problema en los recipientes de ensayo. Por razones de simplificación, la estimación analítica debe efectuarse antes de la adición del inóculo. Debido a que a los recipientes de ensayo solamente se transfieren fracciones disueltas, las concentraciones medidas pueden ser muy bajas.
45.
Para evitar lentos y costosos análisis, se recomienda pesar simplemente la sustancia problema directamente en los recipientes de ensayo y referirse a la concentración nominal inicial pesada para los cálculos posteriores. No es necesario diferenciar entre fracciones disueltas, no disueltas o adsorbidas de la sustancia problema, ya que todas estas fracciones aparecen igualmente en condiciones reales en una planta de tratamiento de aguas residuales, y estas fracciones pueden variar en función de la composición de las aguas residuales. La finalidad del método de ensayo es estimar de forma realista una concentración no inhibidora, y no es adecuado investigar con más detalle qué fracciones aportan su contribución a la inhibición de los microorganismos del lodo activado. Por último, conviene pesar directamente en los recipientes de ensayo también las sustancias adsorbentes, y los recipientes deben silanizarse para reducir al mínimo las pérdidas por adsorción.
DATOS E INFORME
Cálculo de las tasas de absorción de oxígeno
46.
Las tasas de absorción de oxígeno se deben calcular a partir de la media de los valores medidos, por ejemplo de la parte lineal de las gráficas de la concentración de oxígeno frente al tiempo, limitándose los cálculos a las concentraciones de oxígeno entre 2,0 mg/l y 7,0 mg/l, ya que unas concentraciones superiores e inferiores pueden influir en la tasa de consumo. A veces es inevitable y necesario llegar a bandas de concentración por debajo o por encima de estos valores, por ejemplo cuando la respiración se suprime intensamente y, por lo tanto, es muy lenta, o si un lodo activado particular respira con gran rapidez. Esto es aceptable a condición de que las secciones ampliadas de la curva de absorción sean rectas y sus gradientes no cambien al pasar por los límites de 2,0 mg/l o 7,0 mg/l de O2. Las eventuales secciones en curva de la gráfica indican que el sistema de medición se está estabilizando o que la tasa de absorción está cambiando, y no deben utilizarse para el cálculo de las tasas de respiración. La tasa de absorción de oxígeno se debe expresar en miligramos por litro por hora (mg/lh) o miligramos por gramo de lodo seco por hora (mg/gh). La tasa de consumo de oxígeno, R, en mg/lh, puede ser calculada o interpolada a partir de la parte lineal de la curva registrada de disminución del oxígeno de acuerdo con la ecuación 1:
R = (Q1 – Q2)/Δt × 60
(1)
donde:
Q1
es la concentración de oxígeno al inicio de la sección seleccionada de la fase lineal (mg/l);
Q2
es la concentración de oxígeno al final de la sección seleccionada de la fase lineal (mg/l);
Δt
es el intervalo de tiempo entre estas dos mediciones (min).
47.
La tasa de respiración específica (RS) se expresa como la cantidad de oxígeno consumido por gramo de peso seco de lodo en una hora (mg/gh) de acuerdo con la ecuación 2:
Rs = R/SS
(2)
donde SS es la concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de ensayo (g/l).
48.
Los diferentes subíndices de R, que pueden combinarse, son:
S
tasa específica
T
tasa de respiración total
N
tasa debida a la respiración de nitrificación
H
tasa debida a la respiración heterotrófica
A
tasa debida a procesos abióticos
B
tasa de los ensayos en blanco (media).
Cálculo de la tasa de absorción de oxígeno debida a la nitrificación
49.
La relación entre la respiración total (RT), la respiración de nitrificación (RN) y la respiración heterotrófica (RH) viene dada por la ecuación 3:
RN = RT – RH
(3)
donde:
RN
es la tasa de absorción de oxígeno debida a la nitrificación (mg/lh);
RT
es la tasa medida de absorción de oxígeno por el control en blanco (sin ATU; FB) (mg/lh);
RH
es la tasa medida de absorción de oxígeno por el control en blanco al que se ha añadido ATU (FN) (mg/lh).
50.
Esta relación es válida para los valores del blanco (RNB, RTB, RHB), de los controles abióticos (RNA, RTA, RHA) y de los ensayos con sustancias problema (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Las tasas de respiración específicas se calculan de la forma siguiente:
RNS = RN/SS
(4)
RTS = RT/SS
(5)
RHS = RH/SS
(6)
51.
Si RN es insignificante (por ejemplo, < 5 % de RT en los controles en blanco) en un ensayo preliminar, puede considerarse que la absorción heterotrófica de oxígeno es igual a la absorción total y que no se está produciendo nitrificación. Sería necesario recurrir a una fuente alternativa de lodo activado en caso de que los ensayos hubieran de considerar los efectos sobre microorganismos heterotróficos y nitrificantes. Se realiza un ensayo definitivo si hay pruebas de que se reducen las tasas de absorción de oxígeno con diferentes concentraciones de sustancia problema.
Cálculo del porcentaje de inhibición
52.
El porcentaje de inhibición del consumo de oxígeno total, IT, a cada concentración de la sustancia problema se determina mediante la ecuación 7:
IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %
(7)
53.
Análogamente, el porcentaje de inhibición de la absorción de oxígeno heterotrófica, IH, a cada concentración de la sustancia problema se determina mediante la ecuación 8:
IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %
(8)
54.
Finalmente, el porcentaje de inhibición de la absorción de oxígeno debida a la nitrificación, IN, a cada concentración de la sustancia problema se determina mediante la ecuación 9:
IN = [1 – (RT – RH)/ (RTB – RHB)] × 100 %
(9)
55.
El porcentaje de inhibición de la absorción de oxígeno se debe representar gráficamente frente al logaritmo de la concentración de la sustancia problema (curva de inhibición, véase la figura 3 del apéndice 4). Se representan las curvas de inhibición para cada período de aireación de 3 h o con carácter adicional después de 30 minutos. La concentración de la sustancia problema que inhibe la absorción de oxígeno en un 50 % (EC50) debe calcularse o interpolarse a partir de la gráfica. Si se dispone de datos adecuados, pueden calcularse o interpolarse los límites de confianza del 95 % de la EC50, la pendiente de la curva y los valores adecuados para marcar el inicio de la inhibición (por ejemplo, EC10 o EC20) y el final del intervalo de inhibición (por ejemplo, EC80 o EC90).
56.
Ha de señalarse que, en vista de las variaciones observadas con frecuencia en los resultados, en muchos casos puede ser suficiente expresar los resultados además por orden de magnitud, por ejemplo:
EC50
< 1 mg/l
EC50
1 mg/l a 10 mg/l
EC50
10 mg/l a 100 mg/l
EC50
> 100 mg/l
Interpretación de los resultados
ECx
57.
Los valores de ECx junto con sus correspondientes límites de confianza del 95 % inferior y superior para el parámetro se calculan utilizando métodos estadísticos apropiados [por ejemplo, análisis de probit, función logística o de Weibull, método de Spearman-Karber recortado o interpolación simple (11)]. Se obtiene una ECx insertando en la ecuación encontrada un valor correspondiente al x % de la media del control. Para calcular la EC50 o alguna otra ECx, las medias por tratamiento (x) deben someterse a análisis de regresión.
Estimación de la NOEC
58.
Cuando se pretende determinar la NOEC mediante análisis estadístico, es necesario disponer de estadísticas por recipiente (se considera que cada uno de los recipientes es una réplica). Se deben utilizar métodos estadísticos apropiados según el documento de la OCDE sobre Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). En general, los efectos adversos de la sustancia problema en comparación con el control se investigan utilizando contrastes de hipótesis unilaterales (más pequeños) a p ≤ 0,05.
Informe del ensayo
59.
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:
Sustancia problema
—
nombre común, nombre químico, número CAS, pureza;
—
propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema (por ejemplo, log Kow, hidrosolubilidad, presión de vapor, constante de Henry (H) y posible información sobre el destino de la sustancia problema como, por ejemplo, adsorción al lodo activado);
Sistema de ensayo
—
procedencia, condiciones de funcionamiento de la planta de tratamiento de aguas residuales y afluente que recibe, concentración, pretratamiento y mantenimiento del lodo activado;
Condiciones de ensayo
—
temperatura de ensayo, pH durante el ensayo y duración de la fase o fases de exposición;
Resultados
—
consumo específico de oxígeno en los controles (mg O2 / (g lodo × h);
—
todos los datos medidos, curva o curvas de inhibición y método para calcular el valor de EC50;
—
EC50 y, si es posible, límites de confianza del 95 por ciento, en su caso EC20, EC80; eventualmente, la NOEC y los métodos estadísticos utilizados, si no puede determinarse la EC50;
—
resultados de la inhibición total y, si procede, heterotrófica y de nitrificación;
—
absorción abiótica de oxígeno en el control fisicoquímico (si se utiliza);
—
nombre de la sustancia de referencia y resultados con la misma;
—
todas las observaciones y desviaciones del procedimiento normal que puedan haber influido sobre el resultado.
BIBLIOGRAFÍA
(1)
Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.
(2)
King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1 (1): 27-39.
(3)
OCDE (1984). Activated sludge. Respiration inhibition test. Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OCDE, París.
(4)
ISO (2007). ISO 8192. Calidad del agua. Ensayo de inhibición del consumo de oxígeno por lodos activados por oxidación del carbono y del amonio. Organización Internacional de Normalización.
(5)
Bealing, D. J. (2003). Documento ISO/TC147/WGI/N.183, Organización Internacional de Normalización.
(6)
Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-organisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.
(7)
Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.
(8)
Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.
(9)
Fiebig, S. and Noack, U. (2004). The use of copper (II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test — acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.
(10)
ISO (1995). ISO 10634. Calidad del agua. Líneas directrices para la preparación y tratamiento de los compuestos orgánicos poco solubles en agua para la subsecuente evaluación de su biodegradabilidad en medio acuoso. Organización Internacional de Normalización.
(11)
OCDE (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO (2006)18, OCDE, París.
Apéndice 1
Definiciones
En el presente método de ensayo se aplican las siguientes definiciones:
Sustancia : sustancia o mezcla.
ECx (concentración con efecto al x %) : concentración que provoca el x % de un efecto sobre los organismos de ensayo dentro de un determinado período de exposición cuando se compara con un control. Por ejemplo, una EC50 es una concentración de la que se estima que causa un efecto sobre un parámetro de un ensayo en el 50 % de una población expuesta a lo largo de un determinado período de exposición.
NOEC (concentración sin efecto observado) : concentración de la sustancia problema a la que no se observa ningún efecto. En este ensayo, la concentración correspondiente a la NOEC no ejerce ningún efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro de un determinado período de exposición en comparación con el control.
Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.
Apéndice 2
Figura 1. Ejemplos de dispositivo de medición Image
Leyenda
1
Lodo activado
2
Medio sintético
3
Sustancia problema
4
Aire
5
Recipiente de mezclado
6
Agitador magnético
7
Celda de medición de oxígeno
8
Electrodo de oxígeno
9
Instrumento de medición de oxígeno
10
Registrador
Apéndice 3
Figura 2. Ejemplo de dispositivo de medición, con utilización de frasco de DBO Image
Leyenda
1
Recipiente de ensayo
2
Electrodo de oxígeno
3
Instrumento de medición de oxígeno
Apéndice 4
Figura 3. Ejemplo de curvas de inhibición Image
Leyenda
X
Concentración de 3,5-diclorofenol (mg/l)
Y
Inhibición ( %)
Image
inhibición de la respiración heterotrófica con un lodo nitrificante
Image
inhibición de la nitrificación con un lodo nitrificante.
»
5)
El capítulo C.26 se sustituye por el texto siguiente:
«
C. 26. PRUEBA DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE LEMNA SPP.
INTRODUCCIÓN
1.
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 221 (2006). Está diseñado para evaluar la toxicidad de las sustancias para las plantas de agua dulce del género Lemna (lenteja de agua). Se basa en métodos anteriores (1) (2) (3) (4) (5) (6), pero incluye modificaciones de tales métodos para tener en cuenta los resultados de recientes investigaciones y consultas sobre diversos aspectos fundamentales. El método de ensayo se ha validado mediante un ensayo interlaboratorios internacional (7).
2.
Este método describe el ensayo de toxicidad con Lemna gibba y Lemna minor, dos especies que han sido estudiadas ampliamente y son objeto de las normas arriba citadas. La taxonomía de Lemna spp. es difícil y se ve complicada por la existencia de una amplia gama de fenotipos. Aunque puede aparecer variabilidad genética en la respuesta de Lemna a los agentes tóxicos, actualmente no se tienen datos suficientes sobre esta fuente de variabilidad como para recomendar el uso de un clon determinado en el presente método de ensayo. Ha de señalarse que el ensayo no se realiza en condiciones axénicas, pero se toman medidas en distintas fases del procedimiento del ensayo para reducir al mínimo la contaminación por otros organismos.
3.
Se incluyen pormenores de los ensayos con renovación (semiestáticos y dinámicos) y sin renovación (estáticos) de la solución de ensayo. En función de los objetivos del ensayo y de las imposiciones normativas, se recomienda considerar la aplicación de métodos semiestáticos y dinámicos, por ejemplo en caso de sustancias que desparezcan rápidamente de la solución por volatilización, fotodegradación, precipitación o biodegradación. En la referencia (8) se dan más orientaciones.
4.
En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
5.
Se cultivan plantas del género Lemna en fase de crecimiento exponencial como monocultivos expuestos a diferentes concentraciones de la sustancia problema durante un plazo de siete días. El objetivo del ensayo es cuantificar los efectos relacionados con la sustancia sobre el crecimiento vegetativo a lo largo de este plazo, a partir de la evaluación de unas variables de medición seleccionadas. La variable de medición primaria es el número de frondas. Se mide también al menos otra variable de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco), ya que algunas sustancias pueden afectar a otras variables de medición mucho más que al número de frondas. Para cuantificar los efectos relacionados con la sustancia, se compara el crecimiento en las soluciones de ensayo con el de los controles y se determina la concentración que ocasiona una inhibición del crecimiento de un porcentaje especificado (por ejemplo, 50 %), la cual se expresa como ECx (por ejemplo, EC50).
6.
El parámetro del ensayo es la inhibición del crecimiento, expresado como incremento logarítmico de la variable de medición (tasa media de crecimiento específico) durante el tiempo de exposición. A partir de las tasas medias de crecimiento específico registradas en una serie de soluciones de ensayo, se determina la concentración que produce una inhibición especificada del x % de la tasa de crecimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como ErCx (por ejemplo, ErC50).
7.
Otra variable de respuesta utilizada en este método de ensayo es el rendimiento, lo que puede ser necesario en algunos países para cumplir obligaciones específicas derivadas de la normativa. Se define como el valor de las variables de medición al final del tiempo de exposición menos el valor de las variables de medición al inicio de este tiempo. A partir del rendimiento registrado en una serie de soluciones de ensayo, se determina la concentración que produce una inhibición especificada del x % del rendimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como EyCx (por ejemplo, EyC50).
8.
Además, pueden determinarse estadísticamente la concentración mínima con efecto observado (LOEC) y la concentración sin efecto observado (NOEC).
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA
9.
Debe contarse con un método analítico que tenga la sensibilidad adecuada para cuantificar la sustancia en el medio de ensayo.
10.
Entre la información sobre la sustancia problema que puede ser útil para establecer las condiciones del ensayo están los siguientes datos: fórmula estructural, pureza, hidrosolubilidad, estabilidad en el agua y a la luz, pKa, Kow, presión de vapor y biodegradabilidad. La hidrosolubilidad y la presión de vapor pueden utilizarse para calcular la constante de la ley de Henry, que indicará la probabilidad de la pérdida de cantidades significativas de sustancia problema durante el tiempo del ensayo. Esto contribuirá a indicar si deben tomarse medidas particulares para limitar tal pérdida. Cuando sea dudosa la información sobre la solubilidad y estabilidad de la sustancia problema, se recomienda que se evalúen dichos aspectos en las condiciones del ensayo, es decir, con el medio de cultivo, la temperatura y el régimen de iluminación que se vayan a utilizar en el ensayo.
11.
Cuando sea particularmente importante el control del pH del medio de ensayo, por ejemplo cuando se estudien metales o sustancias hidrolíticamente inestables, se recomienda añadir un amortiguador al medio de cultivo (véase el punto 21). En la referencia (8) se ofrece más orientación sobre los ensayos de sustancias con propiedades fisicoquímicas que dificultan estos ensayos.
VALIDEZ DEL ENSAYO
12.
Para que el ensayo sea válido, el tiempo de duplicación del número de frondas en el control debe ser inferior a 2,5 días (60 h), lo que corresponde a una multiplicación por siete en el plazo de siete días y a una tasa media de crecimiento específico de 0,275 d– 1. Con los medios y condiciones de ensayo descritos en el presente método, este criterio puede cumplirse utilizando un régimen estático (5). También se prevé que este criterio se pueda cumplir en condiciones semiestáticas y dinámicas. En el punto 49 se muestra cómo calcular el tiempo de duplicación.
SUSTANCIA DE REFERENCIA
13.
Para comprobar el procedimiento del ensayo pueden someterse a ensayo una o varias sustancias de referencia, como el 3,5-diclorofenol utilizado en el ensayo interlaboratorios internacional (7). Se recomienda efectuar un ensayo con una sustancia de referencia al menos dos veces al año o, si la frecuencia de los ensayos es menor, en paralelo con la determinación de la toxicidad de una sustancia problema.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Equipo
14.
Todo el equipo que entre en contacto con los medios de ensayo será de vidrio o de otro material químicamente inerte. El material de vidrio utilizado para el cultivo y el ensayo estará limpio de contaminantes químicos que puedan pasar al medio de ensayo y además será estéril. Los recipientes de ensayo tendrán la anchura suficiente para que las frondas de las diferentes colonias de los recipientes de control puedan crecer sin solaparse al final del ensayo. No importa si las raíces tocan el fondo de los recipientes de ensayo, pero se recomienda una profundidad mínima de 20 mm y un volumen mínimo de 100 ml en cada recipiente de ensayo. Siempre que se respeten estas normas, no es fundamental el tipo de recipiente de ensayo. Se ha visto que son válidos tanto los vasos de precipitados como los cristalizadores o las placas Petri de vidrio de dimensiones adecuadas. Los recipientes de ensayo estarán cubiertos para minimizar la evaporación y la contaminación accidental, pero sin impedir el necesario intercambio de gases. Los recipientes de ensayo y, en particular, las tapas serán tales que eviten la formación de sombras o la modificación de las características espectrales de la luz.
15.
No se tendrán juntos los cultivos y los recipientes de ensayo, y la mejor forma de conseguirlo es utilizar cámaras, incubadoras o salas de cultivo aparte. Debe ser posible regular la iluminación y la temperatura, y mantenerlas a nivel constante (véanse los puntos 35-36).
Organismo de ensayo
16.
El organismo utilizado para este ensayo es Lemna gibba o Lemna minor. En el apéndice 2 se recogen breves descripciones de especies de lenteja de agua que se han utilizado en ensayos de toxicidad. El material vegetal puede obtenerse de una colección de cultivos, de otro laboratorio o del campo. Si se recogen del campo, las plantas deben mantenerse cultivadas en el mismo medio que se vaya a utilizar para el ensayo al menos en las ocho semanas anteriores a esta utilización. Los lugares del campo utilizados para recoger los cultivos iniciales deben estar libres de fuentes de contaminación evidentes. Si se obtienen de otro laboratorio o de una colección de cultivos, los cultivos deben mantenerse similarmente durante un mínimo de tres semanas. En el informe han de indicarse siempre el origen, la especie y el clon (si se conoce) del material vegetal utilizado para el ensayo.
17.
Deben utilizarse monocultivos que estén claramente exentos de contaminación con otros organismos, como algas o protozoos. Las plantas sanas de L. minor consisten en colonias formadas por entre dos y cinco frondas, mientras que las colonias sanas de L. gibba pueden tener hasta siete frondas.
18.
La calidad y la uniformidad de las plantas empleadas en el ensayo tendrán una influencia significativa sobre el resultado del mismo, por lo que deben seleccionarse con cuidado. Han de utilizarse plantas jóvenes, en fase de crecimiento rápido, que no presenten lesiones visibles ni cambios de color (clorosis). La buena calidad de un cultivo viene indicada por una elevada frecuencia de colonias con un mínimo de dos frondas. Un gran número de frondas aisladas indica tensión ambiental como, por ejemplo, limitación de nutrientes, y el material vegetal de estos cultivos no debe utilizarse en los ensayos.
Cultivo
19.
Para reducir la frecuencia del mantenimiento del cultivo (por ejemplo, cuando no esté previsto efectuar ensayos con Lemna durante cierto tiempo), es posible mantener los cultivos en condiciones de iluminación y temperatura reducidas (4 a 10 °C). En el apéndice 3 se recoge información sobre el mantenimiento de los cultivos. La presencia de signos evidentes de contaminación por algas u otros organismos puede hacer necesaria la esterilización superficial de una submuestra de frondas de Lemna, seguida por su transferencia a medio fresco (véase el apéndice 3). En tal caso, se desechará el resto del cultivo contaminado.
20.
Al menos siete días antes del ensayo, debe transferirse asépticamente a medio estéril fresco un número suficiente de colonias, que se cultivarán durante 7 a 10 días en las condiciones del ensayo.
Medio de ensayo
21.
Se recomienda el uso de medios diferentes para Lemna minor y Lemna gibba, como se describe más abajo. Debe estudiarse cuidadosamente la inclusión de un amortiguador de pH en el medio de ensayo [ácido 4-morfolinopropano-sulfónico (MOPS), no CAS 1132-61-2) en medio de L. minor, y NaHCO3 en medio de L. gibba] si se sospecha que puede reaccionar con la sustancia problema e influir en la expresión de su toxicidad. También es aceptable el medio de Steinberg (9), siempre que se cumplan los criterios de validez.
22.
Para el cultivo de L. minor y los ensayos con ella, se recomienda una modificación del medio de cultivo normal de Suecia (SIS) para Lemna, cuya composición figura en el apéndice 4.
23.
Para el cultivo de L. gibba y los ensayos con ella, se recomienda el medio de cultivo 20X — AAP, tal como se describe en el apéndice 4.
24.
El medio de Steinberg, como se describe en el apéndice 4, es también adecuado para L. minor, aunque puede utilizarse asimismo con L. gibba siempre que se cumplan los criterios de validez.
Soluciones de ensayo
25.
Las soluciones de ensayo se preparan normalmente diluyendo una solución madre. En principio, las soluciones madre de la sustancia problema se preparan disolviendo la sustancia en medio de cultivo.
26.
La mayor concentración estudiada de la sustancia problema no debe superar como norma su hidrosolubilidad en las condiciones de ensayo. No obstante, ha de señalarse que Lemna spp. flota en la superficie y puede exponerse a sustancias que se acumulan en la interfase agua-aire (por ejemplo, sustancias hidrofóbicas o poco hidrosolubles, o sustancias tensioactivas). En tales circunstancias, habrá exposición debida a material que no está disuelto y las concentraciones de ensayo podrán superar la hidrosolubilidad, según las características de la sustancia problema. En caso de sustancias problema de escasa hidrosolubilidad, puede ser necesario preparar una dispersión o solución madre concentrada de la sustancia con un dispersante o disolvente orgánico para facilitar la adición de cantidades exactas de la sustancia problema al medio de ensayo y ayudar a su dispersión y disolución. No obstante, debe evitarse en la mayor medida posible el empleo de tales materiales. El uso de disolventes o dispersantes auxiliares no debe provocar fitotoxicidad. Por ejemplo, entre los disolventes utilizados frecuentemente que no causan fitotoxicidad a concentraciones de hasta 100 μl/l figuran la acetona y la dimetilformamida. Si se utiliza un disolvente o dispersante, su concentración final se indicará en el informe y se mantendrá a un nivel mínimo (≤ 100 μl/l), y todos los recipientes de tratamiento y de control contendrán la misma concentración de disolvente o dispersante. En la referencia (8) se da más información sobre el uso de dispersantes.
Grupos de ensayo y controles
27.
Para seleccionar las concentraciones de ensayo adecuadas es útil disponer de datos anteriores sobre la toxicidad de la sustancia problema para Lemna, como, por ejemplo, datos procedentes de un ensayo de determinación del intervalo. En el ensayo definitivo de toxicidad deben emplearse al menos cinco concentraciones de ensayo dispuestas en progresión geométrica. Lo mejor es que la razón entre las concentraciones de ensayo no sea más de 3,2, pero puede utilizarse un valor superior si la curva concentración-respuesta es plana. Si se usan menos de cinco concentraciones, hay que justificarlo. De cada concentración de ensayo se utilizarán al menos tres réplicas en paralelo.
28.
Al fijar el abanico de concentraciones de ensayo (para el ensayo de determinación del intervalo o para el ensayo definitivo de toxicidad), debe tenerse en cuenta lo siguiente:
—
Para determinar una ECx, es necesario que las concentraciones de ensayo abarquen el valor de ECx a fin de asegurar un nivel adecuado de confianza. Por ejemplo, si se estima la EC50, la mayor concentración de ensayo debe ser superior al valor de EC50. Si el valor de EC50 se encuentra fuera del intervalo de las concentraciones de ensayo, los intervalos de confianza asociados serán amplios y quizá no sea posible efectuar una evaluación adecuada del ajuste estadístico del modelo.
—
Si el objetivo es estimar la LOEC/NOEC, la menor concentración de ensayo debe ser tan baja que el crecimiento correspondiente no sea significativamente inferior al del control. Por otra parte, la mayor concentración de ensayo debe ser tan alta que el crecimiento correspondiente sea significativamente inferior al del control. Si no es así, habrá que repetir el ensayo utilizando un intervalo diferente de concentraciones (salvo que la mayor concentración sea el límite de solubilidad o la concentración límite requerida máxima, por ejemplo 100 mg/l).
29.
Cada ensayo debe incluir controles con un medio nutritivo, número de frondas y colonias, condiciones ambientales y procedimientos iguales que los de los recipientes de ensayo, pero sin la sustancia problema. Si se utiliza un disolvente o dispersante auxiliar, se incluirá un control adicional con el disolvente o dispersante presente en la misma concentración que en los recipientes con la sustancia problema. El número de réplicas de los recipientes de control (y recipientes de disolventes, en su caso) será al menos igual al número de recipientes utilizados con cada concentración de ensayo, y preferentemente el doble de este número.
30.
Si no es necesario determinar la NOEC, el diseño del ensayo puede modificarse para aumentar el número de concentraciones y reducir el número de réplicas por concentración. Sin embargo, el número de réplicas de los controles será al menos de tres.
Exposición
31.
Se transfieren desde el cultivo de inóculo colonias formadas por entre 2 y 4 frondas visibles, repartiéndose aleatoriamente entre los recipientes de ensayo en condiciones asépticas. Cada recipiente de ensayo debe contar con un total de 9 a 12 frondas. En cada uno de ellos habrá el mismo número de frondas y colonias. La experiencia obtenida con este método y los datos del ensayo interlaboratorios indican que el uso de tres réplicas por tratamiento, contando cada una de ellas inicialmente con entre 9 y 12 frondas, es suficiente para detectar diferencias en el crecimiento del orden del 4 al 7 % de la inhibición calculada en tasa de crecimiento (del 10 al 15 % calculada en rendimiento) entre tratamientos (7).
32.
Es necesario un diseño aleatorio de la distribución de los recipientes de ensayo en la incubadora para minimizar la influencia de las diferencias espaciales de intensidad luminosa o temperatura. También es necesario un diseño en bloques o una redistribución aleatoria de los recipientes cuando se hacen observaciones (o una redistribución más frecuente).
33.
Si un ensayo preliminar de estabilidad indica que la concentración de sustancia problema no puede mantenerse (es decir, que la concentración medida cae por debajo del 80 % de la concentración medida inicialmente) a lo largo de la duración del ensayo (7 días), se recomienda un régimen de ensayo semiestático. En tal caso, las colonias deben exponerse a soluciones de ensayo y control recién preparadas en al menos dos ocasiones durante el ensayo (por ejemplo, en los días 3 y 5). La frecuencia de la exposición al medio fresco dependerá de la estabilidad de la sustancia problema; puede ser necesaria una frecuencia mayor para mantener concentraciones cuasiconstantes de sustancias muy inestables o volátiles. En ciertas circunstancias puede hacer falta un procedimiento dinámico (8) (10).
34.
La posibilidad de exposición mediante aplicación foliar (aerosol) no se contempla en el presente método de ensayo; véase en cambio la referencia (11).
Condiciones de incubación
35.
Debe utilizarse continuamente una luz fluorescente blanca fría o cálida que dé una intensidad luminosa seleccionada en el intervalo de 85 a 135 μE · m– 2s– 1 cuando se mide en una radiación activa para la fotosíntesis (400 a 700 nm) en puntos situados a la misma distancia de la fuente luminosa que las frondas de Lemna (equivalente a entre 6 500 y 10 000 lux). Las eventuales diferencias respecto a la intensidad luminosa seleccionada no deben superar el ± 15 % en toda la superficie de ensayo. El método de detección y medición de la luz, en particular el tipo de sensor, influye en el valor medido. La utilización de sensores esféricos (que responden a la luz desde todos los ángulos por encima y por debajo del plano de medición) y de sensores de “coseno” (que responden a la luz desde todos los ángulos por encima del plano de medición) es mejor que la de sensores unidireccionales, y proporciona lecturas más elevadas con una fuente luminosa multipuntual del tipo que se describe aquí.
36.
La temperatura de los recipientes de ensayo debe ser de 24 ± 2 °C. El pH del medio de control no debe subir más de 1,5 unidades durante el ensayo. Sin embargo, una desviación superior a 1,5 unidades no invalida el ensayo si puede demostrarse que se cumplen los criterios de validez. Es necesario prestar atención particular a la deriva del pH en casos especiales, como cuando se estudian metales o sustancias inestables. En la referencia (8) puede encontrarse más información al respecto.
Duración
37.
El ensayo termina a los siete días de la transferencia de las plantas a los recipientes de ensayo.
Mediciones y determinaciones analíticas
38.
Al inicio del ensayo, se cuenta y registra el número de frondas de los recipientes de ensayo, velando por tener en cuenta las frondas prominentes y claramente visibles. Es necesario determinar el número de frondas de aspecto normal o anormal al inicio del ensayo, al menos una vez cada tres días durante el plazo de exposición (es decir, al menos dos veces durante el período de 7 días) y al final del ensayo. Deben anotarse los cambios observados en el desarrollo de las plantas como, por ejemplo, en el tamaño, aspecto, indicación de necrosis, clorosis o protuberancias, rotura de colonias o pérdida de flotabilidad de las frondas, así como en la longitud y aspecto de las raíces. Deben registrarse también las características significativas del medio de ensayo (por ejemplo, presencia de material sin disolver o crecimiento de algas en el recipiente de ensayo).
39.
Además del recuento del número de frondas durante el ensayo, hay que evaluar los efectos de la sustancia problema sobre una o más de las siguientes variables de medición:
i)
superficie total de las frondas;
ii)
peso seco;
iii)
peso fresco.
40.
La superficie total de las frondas tiene la ventaja de que puede determinarse en cada recipiente de ensayo y de control al principio y al final del ensayo, así como durante el mismo. El peso seco o fresco debe determinarse al principio del ensayo a partir de una muestra de cultivo de inóculo representativa del utilizado para empezar el ensayo, y al final de este con el material vegetal de cada recipiente de ensayo y de control. Si no se mide la superficie de las frondas, es mejor determinar el peso seco que el peso fresco.
41.
La superficie total de las frondas, el peso seco y el peso fresco pueden determinarse de la forma siguiente:
i)
Superficie total de las frondas: La superficie total de las frondas de todas las colonias puede determinarse por análisis de imágenes. Puede captarse el contorno del recipiente de ensayo y de las plantas mediante una cámara de vídeo (es decir, poniendo el recipiente en una caja de luz), y después se digitaliza la imagen resultante. A continuación puede determinarse la superficie total de las frondas de un recipiente de ensayo calibrando con plantillas de superficie conocida. Debe procurarse evitar las interferencias debidas al borde del recipiente de ensayo. Otra posibilidad, pero más laboriosa, consiste en fotografiar los recipientes de ensayo y las plantas, recortar el contorno obtenido de las colonias y determinar su superficie mediante un analizador de superficie de hojas o papel milimetrado. También pueden ser adecuadas otras técnicas (por ejemplo, el cociente entre el peso del papel correspondiente a la superficie del contorno de las colonias y el de la superficie unitaria).
ii)
Peso seco: Se recogen todas las colonias de cada uno de los recipientes de ensayo y se lavan con agua destilada o desionizada. Se secan con material absorbente para eliminar el exceso de agua y después se calientan a 60 °C hasta llegar a peso constante. Deben incluirse los eventuales fragmentos de raíces. El peso seco se expresará con una precisión mínima de 0,1 mg.
iii)
Peso fresco: Todas las colonias se transfieren a tubos de poliestireno (u otro material inerte), pesados previamente, con pequeños agujeros (de 1 mm) en los fondos redondeados. A continuación se centrifugan los tubos a 3 000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después se vuelven a pesar los tubos, que contienen las colonias ahora secadas, y el peso fresco se calcula restando el peso del tubo vacío.
Frecuencia de las mediciones y determinaciones analíticas
42.
Si se utiliza un diseño de ensayo estático, debe medirse el pH de cada tratamiento al inicio y al final del ensayo. Si el ensayo es semiestático, el pH debe medirse en cada lote de solución de ensayo “fresca” antes de cada renovación y también en las correspondientes soluciones “gastadas”.
43.
Debe medirse la intensidad luminosa en la cámara, incubadora o sala de cultivo, en puntos situados a la misma distancia de la fuente luminosa que las frondas de Lemna. Esta medición debe efectuarse al menos una vez durante el ensayo. Debe registrarse al menos una vez al día la temperatura del medio en un recipiente indicador mantenido en las mismas condiciones en la cámara, incubadora o sala de cultivo.
44.
Las concentraciones de la sustancia problema se determinan durante el ensayo a intervalos adecuados. Con ensayos estáticos, el requisito mínimo es determinar las concentraciones al inicio y al final del ensayo.
45.
Con ensayos semiestáticos en que no se prevea que la concentración de sustancia problema permanezca en el intervalo del ± 20 % de la concentración nominal, habrá que analizar todas las soluciones de ensayo recién preparadas y las mismas soluciones en cada renovación (véase el punto 33). No obstante, en los ensayos en los que la concentración inicial medida de la sustancia problema no esté dentro del intervalo del ± 20 % de la concentración nominal, pero en los que puedan aportarse pruebas suficientes de que las concentraciones iniciales son repetibles y estables (es decir, que están dentro del intervalo del 80-120 % de la concentración inicial), las determinaciones químicas podrían limitarse a las concentraciones de ensayo máxima y mínima. En todos los casos, la determinación de las concentraciones de la sustancia problema antes de la renovación solo tendrá que efectuarse en uno de los recipientes replicados de cada concentración de ensayo (o en los contenidos reunidos de los recipientes replicados).
46.
Si se utiliza un ensayo dinámico, será adecuado un régimen de muestreo similar al descrito para los ensayos semiestáticos, incluido el análisis al inicio, a la mitad y al final del ensayo, pero en este caso no será apropiado efectuar mediciones de las soluciones “gastadas”. En este tipo de ensayo habrá que comprobar diariamente el caudal de solución madre de sustancia problema o de diluyente y sustancia problema.
47.
Si está demostrado que la concentración de la sustancia problema se ha mantenido satisfactoriamente a lo largo de todo el ensayo dentro de un intervalo de ± 20 % de la concentración nominal o de la medida inicialmente, el análisis de los resultados puede basarse en los valores nominales o medidos inicialmente. Si la desviación respecto a la concentración nominal o medida inicialmente es superior al ± 20 %, el análisis de los resultados deberá basarse en la media geométrica de la concentración durante la exposición o en modelos que describan el descenso de la concentración de la sustancia problema (8).
Ensayo límite
48.
Bajo ciertas circunstancias, por ejemplo cuando un ensayo preliminar indica que la sustancia problema no tiene efectos tóxicos a concentraciones de hasta 100 mg/l, o hasta su límite de solubilidad en el medio de ensayo si este valor es más bajo, puede efectuarse un ensayo límite comparando las respuestas de un grupo de control y de un único grupo de tratamiento (100 mg/l o una concentración igual al límite de solubilidad). Se recomienda vivamente que esto se apoye en un análisis de la concentración de exposición. Todas las condiciones de ensayo y criterios de validez antes descritos son aplicables al ensayo límite, con la excepción de que el número de réplicas de tratamiento ha de duplicarse. El crecimiento en el grupo de control y en el de tratamiento pueden analizarse mediante un método estadístico para comparar las medias como, por ejemplo, una prueba t de Student.
DATOS E INFORME
Tiempo de duplicación
49.
Para determinar el tiempo de duplicación (Td ) del número de frondas y el cumplimiento de este criterio de validez por el estudio (punto 12), se aplicará la fórmula siguiente con datos obtenidos de los recipientes de control:
Td = ln 2/μ
donde μ es la tasa media de crecimiento específico determinada como se describe en los puntos 54-55.
Variables de respuesta
50.
El objetivo del ensayo es determinar los efectos de la sustancia problema sobre el crecimiento vegetativo de Lemna. El presente método de ensayo describe dos variables de respuesta, ya que las distintas jurisdicciones tienen distintas preferencias y necesidades reglamentarias. Para que los resultados del ensayo sean aceptables en todas las jurisdicciones, los efectos deben evaluarse utilizando las dos variables de respuesta a) y b) que se describen a continuación:
a)
Tasa media de crecimiento específico: Esta variable de respuesta se calcula a partir del cambio del logaritmo del número de frondas y, además, a partir del cambio del logaritmo de otro parámetro de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco) a lo largo del tiempo (expresado en días) en los controles y en cada grupo de tratamiento. A veces se denomina tasa de crecimiento relativa (12).
b)
Rendimiento: Esta variable de respuesta se calcula a partir del cambio del número de frondas y, además, a partir del cambio de otro parámetro de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco) en los controles y en cada grupo de tratamiento hasta el final del ensayo.
51.
Ha de señalarse que los valores de toxicidad calculados a partir de estas dos variables de respuesta no son comparables y es necesario tener en cuenta esta diferencia cuando se utilicen los resultados del ensayo. Los valores de ECx basados en la tasa media de crecimiento específico (ErCx) son normalmente más elevados que los basados en el rendimiento (EyCx) si se respetan las condiciones del presente método de ensayo, debido al fundamento matemático de los planteamientos respectivos. Esto no debe interpretarse como una diferencia en la sensibilidad de las dos variables de respuesta, sino como una diferencia puramente matemática entre los valores. El concepto de tasa media de crecimiento específico se basa en el modelo general de crecimiento exponencial de la lenteja de agua en cultivos no limitados, estimándose la toxicidad en función de los efectos sobre la tasa de crecimiento, sin depender del nivel absoluto de la tasa de crecimiento específico del control, de la pendiente de la curva concentración-respuesta ni de la duración del ensayo. Por el contrario, los resultados basados en la variable de respuesta “rendimiento” dependen de todas estas otras variables. La EyCx depende de la tasa de crecimiento específico de la especie de lenteja de agua utilizada en cada ensayo y de la tasa máxima de crecimiento específico, que puede variar de una especie a otra e incluso de un clon a otro. Esta variable de respuesta no debe utilizarse para comparar la sensibilidad de distintas especies, o incluso distintos clones, de lenteja de agua ante un agente tóxico. Aunque científicamente se prefiere el uso de la tasa media de crecimiento específico para estimar la toxicidad, en el presente método de ensayo se incluye también la estimación a partir del rendimiento para cumplir los requisitos reglamentarios vigentes en ciertas jurisdicciones.
52.
Las estimaciones de la toxicidad deben basarse en el número de frondas y en otra variable de medición más (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco), porque ciertas sustancias pueden afectar a otras variables de medición mucho más que al número de frondas. Este efecto no se detectaría si solo se calculara el número de frondas.
53.
El número de frondas y las otras variables de medición registradas (es decir, la superficie total de las frondas, el peso seco o el peso fresco) se tabulan junto con las concentraciones de la sustancia problema correspondientes a cada punto de medición. Todo análisis posterior de los datos, por ejemplo para estimar la LOEC, NOEC o ECx, se basará en los valores de las distintas réplicas y no en los promedios calculados de cada grupo de tratamiento.
Tasa media de crecimiento específico
54.
La tasa media de crecimiento específico correspondiente a un periodo específico se calcula como el incremento logarítmico de las variables de crecimiento, es decir, número de frondas y otra variable de medición (área total de las frondas, peso seco o peso fresco), aplicando la fórmula siguiente a cada réplica de control y de tratamiento:
Formula
donde:
—
μi-j
es la tasa media de crecimiento específico entre el tiempo i y el j
—
Ni
es la variable de medición del recipiente de ensayo o de control en el tiempo i
—
Nj
es la variable de medición del recipiente de ensayo o de control en el tiempo j
—
t
es el tiempo transcurrido entre i y j.
Respecto a cada grupo de tratamiento y de control ha de calcularse un valor medio de la tasa de crecimiento y una estimación de la varianza.
55.
Debe calcularse la tasa media de crecimiento específico correspondiente a toda la duración del ensayo (el tiempo i en la fórmula anterior es el principio del ensayo y el tiempo j es el final del mismo). Respecto a cada concentración de ensayo y control ha de calcularse un valor promedio de la tasa media de crecimiento específico con una estimación de la varianza. Por otra parte, debe considerarse la tasa de crecimiento de cada sección para evaluar el efecto de la sustancia problema presente durante el período de exposición (por ejemplo, examinando curvas logarítmicas de crecimiento). Una diferencia importante entre la tasa de crecimiento de cada sección y la tasa media de crecimiento indica una desviación respecto al crecimiento exponencial constante e impone el examen en detalle de las curvas de crecimiento. En este caso, un enfoque conservador sería comparar las tasas de crecimiento específico de cultivos tratados durante el tiempo de inhibición máxima con las correspondientes a los controles durante el mismo tiempo.
56.
Después puede calcularse el porcentaje de inhibición en tasa de crecimiento (It) correspondiente a cada concentración de ensayo (grupo de tratamiento) aplicando la fórmula siguiente:
Formula
donde:
— :
% Ir
:
es el porcentaje de inhibición en tasa media de crecimiento específico
— :
μC
:
es el valor medio de μ en el control
— :
μT
:
es el valor medio de μ en el grupo de tratamiento
Rendimiento
57.
Los efectos sobre el rendimiento se determinan a partir de dos variables de medición, el número de frondas y otra variable de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco) observadas en cada recipiente de ensayo al inicio y al final del ensayo. En el caso del peso seco o del peso fresco, la biomasa inicial se determina a partir de una muestra de frondas tomada del mismo lote utilizado para inocular los recipientes de ensayo (véase el punto 20). Respecto a cada concentración de ensayo y control ha de calcularse un valor promedio del rendimiento con una estimación de la varianza. El porcentaje medio de inhibición en rendimiento ( % Iy) puede calcularse de la manera siguiente con cada réplica de tratamiento:
Formula
donde:
—
% Iy
es el porcentaje de reducción en rendimiento
—
b
es la biomasa final menos la biomasa inicial correspondiente al grupo de control
—
bT
es la biomasa final menos la biomasa inicial correspondiente al grupo de tratamiento.
Trazado de las curvas concentración-respuesta
58.
Se deben trazar las curvas concentración-respuesta que relacionan el porcentaje medio de inhibición de la variable de respuesta (Ir o Iy, calculado como se indica en los puntos 56 o 57) con el logaritmo de la concentración de la sustancia problema.
Estimación de ECx
59.
Las estimaciones de ECx (por ejemplo, EC50) deben basarse tanto en la tasa media de crecimiento específico (ErCx) como en el rendimiento (EyCx), cada uno de los cuales debe basarse, a su vez, en el número de frondas y en una variable de medición más (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco). El motivo es que ciertas sustancias problema influyen de forma diferente en el número de frondas y en otras variables de medición. Por tanto, los parámetros buscados de la toxicidad son cuatro valores de ECx por cada nivel de inhibición x calculado: ErCx (número de frondas), ErCx (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco), EyCx (número de frondas), y EyCx (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco).
Procedimientos estadísticos
60.
El objetivo es obtener una relación cuantitativa concentración-respuesta mediante análisis de regresión. Es posible utilizar una regresión lineal ponderada después de haber efectuado una transformación linealizante de los datos de respuesta como, por ejemplo, en probit o logit o unidades Weibull (13), pero son preferibles los procedimientos de regresión no lineal porque con ellos se tratan mejor las inevitables irregularidades de los datos y las desviaciones respecto a distribuciones regulares. Si la inhibición está próxima al 0 o al 100 %, la transformación puede magnificar tales irregularidades, interfiriendo así con el análisis (13). Debe señalarse que los métodos normales de análisis que utilizan las transformaciones en probit, logit o de Weibull están previstos para aplicarse a datos cuánticos (por ejemplo, mortalidad o supervivencia), y que es necesario modificarlos para aplicarlos a datos de tasas de crecimiento o rendimiento. En las referencias (14), (15) y (16) pueden encontrarse métodos específicos de determinación de los valores de ECx a partir de datos continuos.
61.
Respecto a cada variable de respuesta que haya de analizarse, se utilizará la relación concentración-respuesta para calcular estimaciones puntuales de los valores de ECx. Cuando sea posible, se determinarán los límites de confianza del 95 % de cada estimación. La bondad del ajuste de los datos de respuesta al modelo de regresión se evaluará de forma gráfica o estadística. El análisis de regresión se efectuará utilizando las respuestas de las distintas réplicas y no los promedios de los grupos de tratamiento.
62.
Las estimaciones de la EC50 y los límites de confianza pueden obtenerse también utilizando la interpolación lineal con remuestreo (bootstrapping) (17) si los métodos o modelos de regresión disponibles no son adecuados para los datos.
63.
Para la estimación de los valores de LOEC y, por tanto, de NOEC, es necesario comparar los promedios de tratamiento utilizando técnicas de análisis de la varianza (ANOVA). A continuación se ha de comparar el promedio obtenido a cada concentración con el del control, aplicando un método apropiado de comparación múltiple o de prueba de tendencia. Las pruebas de Dunnett o Williams pueden ser útiles (18) (19) (20) (21). Hay que comprobar si se sostiene la hipótesis del ANOVA de homogeneidad de la varianza. Esta comprobación puede realizarse gráficamente o mediante una prueba en regla (22). Son adecuadas las pruebas de Levene o Bartlett. El incumplimiento de la hipótesis de homogeneidad de las varianzas puede corregirse a veces mediante la transformación logarítmica de los datos. Si la heterogeneidad de la varianza es extrema y no puede corregirse mediante transformación, ha de considerarse la posibilidad de efectuar un análisis por métodos como las pruebas de tendencia de Jonkheere de ajuste secuencial. En (16) puede encontrarse más información sobre la determinación de la NOEC.
64.
Los recientes avances científicos han llevado a recomendar el abandono del concepto de NOEC para sustituirlo por el de estimaciones puntuales de ECx basadas en la regresión. Aún no se ha determinado un valor adecuado de x para esta prueba con Lemna. Sin embargo, parece que es apropiado el intervalo del 10 al 20 % (según la variable de respuesta elegida) y lo mejor es indicar tanto la EC10 como la EC20.
Elaboración de informes
65.
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:
Sustancia problema:
—
naturaleza física y propiedades fisicoquímicas, incluido el límite de hidrosolubilidad;
—
datos de identificación de la sustancia (por ejemplo, número CAS), incluida la pureza (impurezas).
Especie de ensayo:
—
nombre científico, clon (si se conoce) y procedencia.
Condiciones de ensayo:
—
procedimiento de ensayo aplicado (estático, semiestático o dinámico);
—
fecha de inicio y duración del ensayo;
—
medio de ensayo;
—
descripción del diseño experimental: recipientes de ensayo y sus tapas, volúmenes de solución, número de colonias y de frondas por recipiente de ensayo al inicio del ensayo;
—
concentraciones de ensayo (nominales y medidas, según proceda) y número de réplicas por concentración;
—
métodos de preparación de las soluciones madre y problema, incluido el eventual uso de disolventes o dispersantes;
—
temperatura durante el ensayo;
—
fuente, intensidad y homogeneidad de la luz;
—
valores de pH de los medios de ensayo y de control;
—
concentraciones de la sustancia problema y método de análisis con datos adecuados de evaluación de la calidad (estudios de validación, desviaciones típicas o límites de confianza de los análisis);
—
métodos de determinación del número de frondas y otras variables de medición como, por ejemplo, el peso seco, el peso fresco o la superficie de las frondas;
—
todas las desviaciones respecto al presente método de ensayo.
Resultados:
—
datos en bruto: número de frondas y otras variables de medición en cada recipiente de ensayo y de control en cada observación y momento de análisis;
—
medias y desviaciones típicas de cada variable de medición;
—
curvas de crecimiento de cada concentración (se recomienda con transformación logarítmica de la variable de medición, véase el punto 55);
—
tiempo de duplicación / tasa de crecimiento en el control según el número de frondas;
—
variables de respuesta calculadas para cada réplica de tratamiento, con valores medios y coeficiente de variación de las réplicas;
—
representación gráfica de la relación concentración-efecto;
—
estimaciones de parámetros de la toxicidad correspondientes a variables de respuesta como, p. ej., EC50, EC10, EC20, e intervalos de confianza asociados; en caso de que se calculen la LOEC o la NOEC, se indicarán sus valores y los métodos estadísticos utilizados en su determinación;
—
si se ha utilizado el ANOVA, el tamaño del efecto que puede observarse (por ejemplo, la diferencia significativa mínima);
—
la eventual estimulación del crecimiento que se haya observado en cualquier recipiente de tratamiento;
—
los eventuales signos visibles de fitotoxicidad así como observaciones de las soluciones de ensayo;
—
discusión de los resultados del ensayo, incluida la eventual influencia que tengan sobre ellos las desviaciones respecto al presente método de ensayo.
BIBLIOGRAFÍA
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(21)
Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519-531.
(22)
Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
Apéndice 1
Definiciones
En relación con el presente método de ensayo se aplicarán las siguientes definiciones y abreviaturas:
Biomasa : peso seco de materia viva presente en una población. En este ensayo, lo que se mide normalmente son indicadores de la biomasa, como el número de frondas o la superficie de las frondas, por lo que el término de “biomasa” se refiere también a estos indicadores.
Sustancia : sustancia o mezcla.
Clorosis : amarilleamiento del tejido de la fronda.
Clon : organismos o células procedentes de un solo individuo por reproducción asexual. Los individuos del mismo clon son, por tanto, genéticamente idénticos.
Colonia : conjunto de frondas madre e hijas (generalmente de 2 a 4) unidas entre sí. A veces se le da el nombre de planta.
ECx : concentración de la sustancia problema disuelta en el medio de ensayo que produce una reducción del x % (por ejemplo, del 50 %) en el crecimiento de Lemna dentro de un plazo de exposición definido (que debe indicarse explícitamente si es distinto de la duración completa o normal del ensayo). Para expresar de forma inequívoca el valor de EC obtenido a partir de la tasa de crecimiento o del rendimiento, se usan respectivamente los símbolos “ErC” y “EyC”, seguidos de la variable de medición que se ha utilizado, por ejemplo ErC (número de frondas).
Ensayo dinámico : ensayo en que las soluciones de ensayo se renuevan continuamente.
Fronda : cada una de las estructuras “foliáceas” simples de una planta de lenteja de agua. Es la unidad mínima, es decir, individuo, capaz de reproducirse.
Deformación : presencia de frondas con protuberancias o aspecto hinchado.
Crecimiento : aumento de la variable de medición, por ejemplo el número de frondas, el peso seco, el peso húmedo o la superficie de las frondas, a lo largo de la duración del ensayo.
Tasa de crecimiento (tasa media de crecimiento específico): aumento logarítmico de la biomasa durante el período de exposición.
Concentración mínima con efecto observado (LOEC) : concentración estudiada mínima a la que se observa que la sustancia ejerce un efecto estadísticamente significativo de reducción del crecimiento (con p < 0,05) cuando se compara con el control, dentro de un tiempo de exposición dado. Sin embargo, es necesario también que todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC ejerzan un efecto nocivo superior o igual al que se observa con dicha concentración. Si no se cumplen estas dos condiciones, es preciso dar una explicación completa sobre cómo se ha elegido la LOEC (y, por tanto, la NOEC).
Variables de medición : variables de cualquier tipo que se miden para expresar el parámetro del ensayo utilizando una o más variables de respuesta diferentes. En este método se consideran variables de medición el número de frondas, la superficie de las frondas, el peso fresco y el peso seco.
Monocultivo : cultivo con una sola especie vegetal.
Necrosis : tejido de la fronda muerto (es decir, blanco o saturado de agua).
Concentración sin efecto observado (NOEC) : concentración estudiada que se encuentra inmediatamente por debajo de la LOEC.
Fenotipo : características observables de un organismo determinadas por la interacción de sus genes con su entorno.
Variables de respuesta : variables para la estimación de la toxicidad derivadas de cualquier variable de medición que describa la biomasa por distintos métodos de cálculo. A efectos del presente método de ensayo, las tasas de crecimiento y el rendimiento son variables de respuesta derivadas de variables de medición como el número de frondas, la superficie de las frondas, el peso fresco o el peso seco.
Ensayo semiestático (de renovación) : ensayo en que, a lo largo de su duración, la solución de ensayo se sustituye periódicamente, a intervalos específicos.
Ensayo estático : ensayo en que, a lo largo de su duración, no hay renovación de la solución de ensayo.
Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.
Parámetro del ensayo : factor general que, como objetivo del ensayo, es modificado por la sustancia problema respecto al control. En este método el parámetro del ensayo es la inhibición del crecimiento, que se puede expresar mediante diferentes variables de respuesta, basadas en una o más variables de medición.
Medio de ensayo : medio de cultivo sintético y completo en que crecen las plantas del ensayo cuando se exponen a la sustancia problema. Esta se disuelve en principio en el medio de ensayo.
Rendimiento : valor de una variable de medición para expresar la biomasa al final del período de exposición menos el valor de la variable de medición al inicio del período de exposición.
Apéndice 2
Descripción de Lemna spp.
La planta acuática denominada vulgarmente lenteja de agua, Lemna spp., pertenece a la familia Lemnaceae, que tiene varias especies de distribución mundial recogidas en cuatro géneros. Se han descrito exhaustivamente sus diferencias de aspecto y taxonomía (1) (2). Lemna gibba y Lemna minor son especies representativas de las zonas templadas y se utilizan frecuentemente en estudios de toxicidad. Ambas especies tienen un tallo discoidal (fronda) flotante o sumergido y una raíz muy fina que sale del centro de la superficie inferior de cada fronda. Las especies de Lemna no suelen echar flores, y las plantas se reproducen vegetativamente haciendo nuevas frondas (3). En comparación con las plantas viejas, las jóvenes tienden a ser más pálidas, tener raíces más cortas y consistir en dos o tres frondas de distintos tamaños. El pequeño tamaño, la sencillez de la estructura, la reproducción asexual y el breve tiempo de generación de Lemna son características que convierten a las plantas de este género en idóneas para los ensayos de laboratorio (4) (5).
Debido a la probabilidad de que haya diferencias de sensibilidad entre las especies, solo son válidas las comparaciones de sensibilidad dentro de una misma especie.
Ejemplos de especies de Lemna que se utilizan en los ensayos: referencias bibliográficas de las especies
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.
Lemna major : Clark, N.A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. Phys. Chem., 29: 935-941.
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA) (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8 pp.
Association Française de Normalisation (AFNOR) (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 pp.
Swedish Standards Institute (SIS) (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 pp. (en sueco).
Lemna gibba : ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998), pp. 733-742.
United States Environmental Protection Agency (US EPA) (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8 pp.
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.
Lemna trisulca : Huebert, D.B., Shay, J.M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 483.
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.
Fuentes de las especies de Lemna
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria
Department of Botany, University of Toronto, Toronto, Ontario
Canadá, M5S 3 B2
Tel: +1-416-978-3641
Fax:+1-416-978-5878
Correo electrónico: jacreman@botany.utoronto.ca
North Carolina State University
Forestry Dept
Duckweed Culture Collection
Campus Box 8002
Raleigh, NC 27695-8002
Estados Unidos
Teléfono: 001 (919) 515-7572
astomp@unity.ncsu.edu
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University
SE-106 91
Estocolmo
Suecia
Tel: +46 8 674 7240
Fax: +46 8 674 7636
Umweltbundesamt (UBA)
FG III 3.4
Schichauweg 58
12307 Berlín
Alemania
Correo electrónico: lemna@uba.de
BIBLIOGRAFÍA
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(5)
Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.
Apéndice 3
Mantenimiento de cultivos madre
Los cultivos madre pueden mantenerse a temperaturas bajas (4-10 oC) durante tiempos prolongados sin tener que volver a reestablecerlos. El medio de cultivo de Lemna puede ser el mismo que se utilice en los ensayos, pero es posible utilizar otros medios ricos en nutrientes para los cultivos madre.
Periódicamente se pasan varias plantas jóvenes, de color verde claro, a nuevos recipientes de cultivo con medio fresco, aplicando una técnica aséptica. En las condiciones de baja temperatura que se indican, pueden hacerse subcultivos a intervalos de hasta tres meses.
Para los cultivos deben utilizarse recipientes estériles de vidrio, químicamente limpios (lavados con ácido); su manipulación se hará asépticamente. En caso de contaminación del cultivo madre, por ejemplo con algas u hongos, se tomarán medidas para eliminar los organismos contaminantes. En relación con las algas y la mayoría de otros organismos contaminantes, esto puede efectuarse mediante esterilización superficial. Se toma una muestra del material vegetal contaminado y se cortan las raíces. A continuación se agita enérgicamente el material en agua limpia, y después se sumerge en solución de hipoclorito sódico al 0,5 % (v/v) durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 5 minutos. Seguidamente se enjuaga el material vegetal con agua estéril y se transfiere, en una serie de lotes, a recipientes de cultivo con medio de cultivo fresco. Aunque este tratamiento puede ocasionar la muerte de muchas frondas, especialmente con tiempos largos de exposición, algunas de las frondas supervivientes estarán normalmente libres de contaminación y podrán utilizarse para reinocular nuevos cultivos.
Apéndice 4
Medios
Se recomiendan medios de cultivo distintos para L. minor y L. gibba. Para L. minor se recomienda una modificación del medio de cultivo normal de Suecia (SIS), y para L. gibba, el medio 20X AAP. A continuación se indican las composiciones de ambos medios. Para preparar estos medios deben utilizarse sustancias de grado analítico o reactivo y agua desionizada.
Medio de cultivo normal de Suecia (SIS) para Lemna
—
Las soluciones madre I – V se esterilizan en autoclave (120 °C, 15 minutos) o mediante filtración por membrana (de unos 0,2 μm de diámetro de poro).
—
Las soluciones madre VI y, en su caso, VII se esterilizan solo mediante filtración por membrana; no deben tratarse en autoclave.
—
Las soluciones madre estériles deben conservarse en lugar fresco y oscuro. Las soluciones madre I – V pueden conservarse hasta seis meses, mientras que las soluciones madre VI y, en su caso, VII deben desecharse al cabo de un solo mes.
Solución madre no
Sustancia
Concentración en la solución madre
(g/l)
Concentración en el medio preparado
(gl/l)
Medio preparado
Elemento
Concentración
(mg/l)
I
NaNO3
8,50
85
Na; N
32; 14
KH2PO4
1,34
13,4
K; P
6,0; 2,4
II
MgSO4 · 7H2O
15
75
Mg; S
7,4; 9,8
III
CaCl2 · 2H2O
7,2
36
Ca; Cl
9,8; 17,5
IV
Na2CO3
4,0
20
C
2,3
V
H3BO3
1,0
1,00
B
0,17
MnCl2 · 4H2O
0,20
0,20
Mn
0,056
Na2MoO4 · 2H2O
0,010
0,010
Mo
0,0040
ZnSO4 · 7H2O
0,050
0,050
Zn
0,011
CuSO4 · 5H2O
0,0050
0,0050
Cu
0,0013
Co (NO3)2 · 6H2O
0,010
0,010
Co
0,0020
VI
FeCl3 · 6H2O
0,17
0,84
Fe
0,17
Na2EDTA · 2H2O
0,28
1,4
— —
VII
MOPS (amortiguador)
490
490
— —
Para preparar un litro de medio SIS, se añaden los volúmenes siguientes a 900 ml de agua desionizada:
—
10 ml de solución madre I
—
5 ml de solución madre II
—
5 ml de solución madre III
—
5 ml de solución madre IV
—
1 ml de solución madre V
—
5 ml de solución madre VI
—
1 ml de solución madre VII (facultativo)
Nota: Con ciertas sustancias problema (véase el punto 11) puede ser necesaria además la solución madre VII (amortiguador de MOPS).
El pH se ajusta a 6,5 ± 0,2 con HCl o NaOH 0,1 o 1 M, y el volumen se lleva a un litro con agua desionizada.
Medio de cultivo 20X AAP
Las soluciones madre se preparan con agua destilada o desionizada estéril.
Las soluciones madre estériles deben conservarse en lugar fresco y oscuro. En estas condiciones pueden mantenerse durante al menos 6 u 8 semanas.
Para obtener este medio 20X AAP se necesitan cinco soluciones madre de nutrientes (A1, A2, A3, B y C), preparadas con sustancias de grado reactivo. A unos 850 ml de agua desionizada se añaden 20 ml de cada solución madre de nutrientes para obtener el medio de cultivo. El pH se ajusta a 7,5 ± 0,1 con HCl o NaOH 0,1 o 1 M, y el volumen se lleva a un litro con agua desionizada. Después se pasa el medio a un recipiente estéril a través de un filtro de membrana de unos 0,2 μm.
El medio de cultivo destinado a los ensayos debe prepararse uno o dos días antes de usarlo, a fin de que el pH pueda estabilizarse. Antes de utilizar el medio de cultivo, se comprobará su pH y, en caso necesario, se ajustará añadiendo NaOH o HCl 0,1 o 1 M, como se describe más arriba.
Solución madre no
Sustancia
Concentración en la solución madre
(g/ߦl) (7)
Concentración en el medio preparado
(mg/ߦl) (7)
Medio preparado
Elemento
Concentración
(mg/ߦl) (7)
A1
NaNO3
26
510
Na; N
190; 84
MgCl2 · 6H2O
12
240
Mg
58,08
CaCl2 · 2H2O
4,4
90
Ca
24,04
A2
MgSO4 · 7H2O
15
290
S
38,22
A3
K2HPO4 · 3H2O
1,4
30
K; P
9,4; 3,7
B
H3BO3
0,19
3,7
B
0,65
MnCl2 · 4H2O
0,42
8,3
Mn
2,3
FeCl3 · 6H2O
0,16
3,2
Fe
0,66
Na2EDTA · 2H2O
0,30
6,0
— —
ZnCl2
3,3 mg/l
66 μg/l
Zn
31 μg/l
CoCl2 · 6H2O
1,4 mg/l
29 μg/l
Co
7,1 μg/l
Na2MoO4 · 2H2O
7,3 mg/l
145 μg/l
Mo
58 μg/l
CuCl2 · 2H2O
0,012 mg/l
0,24 μg/l
Cu
0,080 μg/l
C
NaHCO3
15
300
Na; C
220; 43
Medio de Steinberg (según ISO 20079)
Concentraciones y soluciones madre
El medio modificado de Steinberg se utiliza según la norma ISO 20079 con Lemna minor solo (ya que en esa norma solo se contempla esta especie), pero los ensayos muestran que pueden obtenerse buenos resultados también con Lemna gibba.
Para preparar el medio deben utilizarse sustancias de grado analítico o reactivo y agua desionizada.
El medio nutritivo se prepara a partir de soluciones madre o del medio diez veces más concentrado, que permite una concentración máxima del medio sin precipitación.
Cuadro 1.
Medio de Steinberg con pH estabilizado (modificado según Altenburger)
Componente
Medio nutritivo
Macroelementos
Peso molecular
mg/l
mmol/l
KNO3
101,12
350,00
3,46
Ca (NO3)2 · 4H2O
236,15
295,00
1,25
KH2PO4
136,09
90,00
0,66
K2HPO4
174,18
12,60
0,072
MgSO4 · 7H2O
246,37
100,00
0,41
Microelementos
Peso molecular
μg/l
μmol/l
H3BO3
61,83
120,00
1,94
ZnSO4 · 7H2O
287,43
180,00
0,63
Na2MoO4 · 2H2O
241,92
44,00
0,18
MnCl2 · 4H2O
197,84
180,00
0,91
FeCl3 · 6H2O
270,21
760,00
2,81
EDTA disódico dihidratado
372,24
1 500,00
4,03
Cuadro 2.
Soluciones madre (macroelementos)
1.
Macroelementos (concentración 50 veces mayor)
g/l
Solución madre 1:
KNO3
17,50
KH2PO4
4,5
K2HPO4
0,63
Solución madre 2:
MgSO4 · 7H2O
5,00
Solución madre 3:
Ca (NO3)2 · 4H2O
14,75
Cuadro 3.
Soluciones madre (microelementos)
2.
Microelementos (concentración 1 000 veces mayor)
mg/l
Solución madre 4:
H3BO3
120,0
Solución madre 5:
ZnSO4 · 7H2O
180,0
Solución madre 6:
Na2MoO4 · 2H2O
44,0
Solución madre 7:
MnCl2 · 4H2O
180,0
Solución madre 8:
FeCl3 · 6H2O
760,00
EDTA disódico dihidratado
1 500,00
—
Pueden reunirse las soluciones madre 2 y 3 por un lado y, por otro, de la 4 a la 7 (teniendo en cuenta las concentraciones establecidas).
—
Para poder conservarlas más tiempo, hay que tratar las soluciones madre en autoclave a 121 °C durante 20 min o bien someterlas a esterilización por filtración (0,2 μm). Se recomienda vivamente someter la solución madre 8 a esterilización por filtración (0,2 μm).
Preparación del medio de Steinberg (modificado) a la concentración final
—
Se añaden 20 ml de las soluciones madre 1, 2 y 3 (véase el cuadro 2) a unos 900 ml de agua desionizada para evitar la precipitación.
—
Se añade 1,0 ml de las soluciones madre 4, 5, 6, 7 y 8 (véase el cuadro 3).
—
El pH debe ser de 5,5 ± 0,2 (se ajusta añadiendo un volumen mínimo de solución de NaOH o HCl).
—
Se completa con agua hasta 1 000 ml.
—
Si las soluciones madres están esterilizadas y se utiliza agua adecuada, no es necesario proceder a otra esterilización. Si se efectúa la esterilización del medio final, la solución madre 8 se añadirá después del pase por autoclave (a 121 °C durante 20 min).
Preparación del medio de Steinberg (modificado) a concentración 10 veces mayor para su conservación intermedia
—
Se añaden 20 ml de las soluciones madre 1, 2 y 3 (véase el cuadro 2) a unos 30 ml de agua para evitar la precipitación.
—
Se añade 1,0 ml de las soluciones madre 4, 5, 6, 7 y 8 (véase el cuadro 3). Se completa con agua hasta 100 ml.
—
Si las soluciones madres están esterilizadas y se utiliza agua adecuada, no es necesario proceder a otra esterilización. Si se efectúa la esterilización del medio final, la solución madre 8 se añadirá después del pase por autoclave (a 121 °C durante 20 min).
—
El pH del medio (concentración final) debe ser de 5,5 ± 0,2.
»
6)
Se añaden los siguientes capítulos C.31 a C.46:
«
C.31. ENSAYO CON PLANTAS TERRESTRES: ENSAYO DE EMERGENCIA Y CRECIMIENTO DE PLÁNTULAS
INTRODUCCIÓN
1.
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 208 (2006). Los métodos de ensayo se revisan periódicamente en función de los avances científicos y de su aplicabilidad con fines reglamentarios. La presente actualización del método de ensayo está diseñada para evaluar los efectos potenciales de las sustancias sobre la emergencia y el crecimiento de plántulas. Sin embargo, no cubre los efectos crónicos ni los efectos sobre la función reproductora (es decir, semillas, formación de las flores, maduración de los frutos). Deben considerarse las condiciones de exposición y las propiedades de la sustancia problema, a fin de garantizar que se utilizan los métodos de ensayo apropiados (por ejemplo, cuando se estudian metales o compuestos metálicos, deben considerarse los efectos del pH y los contra-iones asociados) (1). Este método de ensayo no se ocupa de las plantas expuestas a vapores de las sustancias. El método de ensayo es aplicable a los ensayos de sustancias y mezclas en general, biocidas y productos fitosanitarios (también conocidos como plaguicidas o pesticidas). Se ha desarrollado sobre la base de métodos existentes (2) (3) (4) (5) (6) (7). También se han tenido en cuenta otras referencias pertinentes para los ensayos con plantas (8) (9) (10). En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
2.
El ensayo evalúa los efectos sobre la emergencia y el crecimiento inicial de las plántulas de vegetales superiores tras su exposición a la sustancia problema en el suelo (u otra matriz de suelo adecuada). Las semillas se ponen en contacto con suelo que se ha tratado con la sustancia problema y se evalúan los efectos que presenten después de, generalmente, entre 14 y 21 días tras la emergencia del 50 % de las plántulas del grupo de control. Los parámetros medidos son la evaluación visual de la emergencia de plántulas, el peso seco de los brotes (o el peso fresco de los brotes) y, en algunos casos, la altura de los brotes, así como una evaluación de los efectos nocivos sobre diferentes partes de la planta. Estas mediciones y observaciones se comparan con las de las plantas de control sin tratar.
3.
En función de la vía de exposición prevista, la sustancia problema se incorpora al suelo (o bien a una matriz de suelo artificial) o se aplica a la superficie del suelo, de forma que se represente adecuadamente la posible vía de exposición a la sustancia. La incorporación al suelo se realiza por tratamiento de suelo bruto. Después de la aplicación, el suelo se transfiere a macetas y, a continuación, se siembran en el suelo semillas de la especie vegetal seleccionada. Las aplicaciones en superficie se hacen con suelo en macetas en el que ya se han sembrado las semillas. Las unidades de ensayo (controles y suelos tratados más semillas) se colocan entonces en condiciones adecuadas que permitan la germinación o el crecimiento de las plantas.
4.
El ensayo puede efectuarse con el fin de determinar la curva dosis-respuesta, o a una sola concentración/tasa como ensayo límite, en función del objetivo del estudio. Si los resultados del ensayo a concentración/tasa única superan un determinado nivel de toxicidad (por ejemplo, si se observan efectos superiores a un x %), se lleva a cabo un ensayo de determinación del intervalo para establecer los límites inferior y superior de toxicidad, seguido de un ensayo a concentración/tasa múltiple para generar una curva dosis-respuesta. Se efectúa un análisis estadístico apropiado para obtener una concentración con efecto x ECx o una tasa de aplicación con efecto x ERx (p. ej., EC25, ER25, EC50, ER50) en relación con el parámetro o parámetros de interés más sensibles. Asimismo, en esta prueba pueden calcularse la concentración sin efecto observado (NOEC) y la concentración mínima con efecto observado (LOEC).
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA
5.
La siguiente información es útil para la identificación de la vía prevista de exposición a la sustancia y para el diseño del ensayo: fórmula estructural, pureza, hidrosolubilidad, solubilidad en disolventes orgánicos, coeficiente de reparto 1-octanol/agua, comportamiento de sorción del suelo, presión de vapor, estabilidad de la sustancia en el agua y a la luz, y biodegradabilidad.
VALIDEZ DEL ENSAYO
6.
Para que el ensayo se considere válido, los controles deben cumplir los criterios de comportamiento siguientes:
—
la emergencia de las plántulas es de al menos un 70 %;
—
las plántulas no presentan efectos fitotóxicos visibles (p. ej., clorosis, necrosis, marchitamiento, deformaciones de las hojas y tallos) y las plantas presentan solo variaciones en el crecimiento y morfología que son normales para la especie concreta de que se trate;
—
la supervivencia media de las plántulas de control emergidas es de al menos el 90 % a lo largo de todo el estudio;
—
las condiciones ambientales de una determinada especie son idénticas y los medios de cultivo contienen la misma cantidad de matriz de suelo, medio de apoyo, o sustrato de la misma fuente.
SUSTANCIA DE REFERENCIA
7.
Puede someterse a ensayo una sustancia de referencia a intervalos regulares, con el fin de comprobar que el comportamiento del ensayo y la respuesta de las plantas concretas del ensayo, así como las condiciones de ensayo no han cambiado de forma significativa a lo largo del tiempo. Los datos anteriores de biomasa o de crecimiento de los controles pueden utilizarse también para evaluar el comportamiento del sistema de ensayo en laboratorios concretos, y pueden constituir una medida de control de la calidad intralaboratorio.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Suelo natural — sustrato artificial
8.
Se pueden cultivar las plantas en macetas con suelo de limo arenoso, de arena limosa, o de limo arenoso y arcilloso, que contenga hasta un 1,5 % de carbono orgánico (alrededor del 3 % de materia orgánica). También puede utilizarse tierra comercial para macetas o mezcla de suelo sintético que contenga hasta un 1,5 % de carbono orgánico. No deben utilizarse suelos arcillosos si se sabe que la sustancia problema tiene elevada afinidad por la arcilla. El suelo de campo debe pasarse por un tamiz de 2 mm de luz para homogeneizarlo y eliminar las partículas gruesas. Deben indicarse el tipo y la textura, el porcentaje de carbono orgánico, el pH y el contenido de sal, así como la conductividad electrónica del suelo preparado final. El suelo debe clasificarse con arreglo a un sistema de clasificación normal (11). El suelo puede pasteurizarse o someterse a tratamiento térmico para reducir el efecto de los patógenos del suelo.
9.
El suelo natural puede complicar la interpretación de los resultados y aumentar la variabilidad debido a su diversidad de propiedades físicas y químicas y de poblaciones microbianas. Estas variables, a su vez, alteran la capacidad de retención de humedad, la capacidad de formar enlaces químicos, la aireación y el contenido de nutrientes y de oligoelementos. Además de las variaciones de estos factores físicos, también habrá variaciones en sus propiedades químicas, tales como el pH y el potencial redox, lo que puede afectar a la biodisponibilidad de la sustancia problema (12) (13) (14).
10.
Los sustratos artificiales no se emplean normalmente para los ensayos de productos fitosanitarios, pero pueden ser de utilidad para los ensayos de sustancias o mezclas en general o cuando se desee reducir al mínimo la variabilidad de los suelos naturales y aumentar la comparabilidad de los resultados de los ensayos. Los sustratos utilizados deben estar compuestos de materiales inertes que minimicen la interacción con la sustancia problema, con el vehículo disolvente, o con ambos. Se ha visto que la arena de cuarzo lavada con ácido, la lana mineral y las perlas de vidrio (por ejemplo, de 0,35 a 0,85 mm de diámetro) son materiales inertes adecuados que absorben mínimamente la sustancia problema (15), garantizando así un máximo de disponibilidad de la sustancia para las plántulas a través de la absorción radicular. Entre los sustratos inadecuados figuran la vermiculita, la perlita y otros materiales muy absorbentes. Deben facilitarse nutrientes para el crecimiento vegetal, a fin de asegurarse de que las plantas no sufren deficiencias nutricionales, y, siempre que sea posible, este aspecto debe evaluarse mediante análisis químico o por examen visual de las plantas de control.
Criterios de selección de las especies de ensayo
11.
Las especies seleccionadas deben ser suficientemente amplias, p. ej., teniendo en cuenta su diversidad taxonómica en el reino vegetal, su distribución, abundancia, las características del ciclo de vida específico de la especie y la región de presencia natural, a fin de desarrollar una gama de respuestas (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Para la selección deben tenerse en cuenta las siguientes características de las posibles especies de ensayo:
—
las especies tienen semillas uniformes que están fácilmente disponibles a partir de fuentes normales fiables y que presentan una germinación regular, fiable y homogénea, y las plántulas tienen un crecimiento uniforme;
—
las plantas son aptas para el ensayo en laboratorio, y pueden dar resultados fiables y reproducibles, tanto dentro de una misma instalación como en una serie de instalaciones;
—
la sensibilidad de las especies sometidas a ensayo debe ser coherente con las respuestas de las plantas observadas en el medio ambiente expuestas a la sustancia;
—
se han utilizado en cierta medida en ensayos anteriores de toxicidad y su utilización en, por ejemplo, bioensayos de herbicidas, detección de metales pesados, pruebas de resistencia a la salinidad o a los minerales, o estudios de alelopatía indica sensibilidad a una gran variedad de factores de estrés;
—
son compatibles con las condiciones de cultivo del método de ensayo;
—
cumplen los criterios de validez del ensayo.
Algunas de las especies de ensayo más utilizadas a lo largo del tiempo se recogen en el apéndice 2, y el apéndice 3 muestra posibles especies no cultivadas.
12.
El número de especies que se ha de someter a ensayo depende de los requisitos normativos correspondientes, por lo que no se especifica en el presente método de ensayo.
Aplicación de la sustancia problema
13.
La sustancia debe aplicarse en un vehículo adecuado (por ejemplo, agua, acetona, etanol, polietilenglicol, goma arábiga, arena). También pueden someterse a ensayo las mezclas (productos formulados o formulaciones) que contienen principios activos y varios coadyuvantes.
Incorporación al suelo o al sustrato artificial
14.
Las sustancias que son hidrosolubles o se suspenden en agua pueden añadirse al agua y, a continuación, la solución se mezcla con el suelo, mediante un dispositivo de mezcla. Este tipo de ensayo puede ser adecuado si la exposición a la sustancia se hace a través del suelo o del agua intersticial del suelo y cuando hay riesgo de absorción radicular. La adición de la sustancia problema no debe superar la capacidad de retención de humedad del suelo. El volumen de agua añadida debe ser el mismo para cada concentración de ensayo, pero debe limitarse para evitar que el suelo se aglutine en agregados.
15.
Las sustancias con poca hidrosolubilidad han de disolverse en un disolvente volátil adecuado (p. ej., acetona, etanol), y mezclarse con arena. El disolvente puede eliminarse de la arena a continuación con una corriente de aire al tiempo que se remueve continuamente la arena. La arena tratada se mezcla con el suelo experimental. Se establece un segundo control que solo recibe arena y disolvente. Se añaden a todos los niveles de tratamiento y al segundo control las mismas cantidades de arena, con disolvente mezclado y eliminado. En el caso de sustancias problema sólidas insolubles, se mezclan la sustancia y el suelo seco en un mezclador adecuado. A continuación se añade el suelo a las macetas y se siembran las semillas de forma inmediata.
16.
Cuando se utiliza un sustrato artificial en lugar de suelo, las sustancias hidrosolubles pueden disolverse en la solución de nutrientes justo antes del inicio del ensayo. Las sustancias que no son hidrosolubles, pero que pueden suspenderse en agua utilizando un vehículo disolvente, deben añadirse con el vehículo a la solución de nutrientes. Las sustancias que no son hidrosolubles y para las que no se dispone de ningún vehículo hidrosoluble no tóxico han de disolverse en un disolvente volátil adecuado. La solución se mezcla con arena o perlas de vidrio, se coloca en un aparato rotativo de vacío y se somete a evaporación, para que quede en la arena o en las perlas una capa uniforme de la sustancia. Una porción pesada de perlas debe someterse a extracción con el mismo disolvente orgánico y se determina en ella la sustancia problema, antes de llenar las macetas.
Aplicación en superficie
17.
En el caso de los productos fitosanitarios, para la aplicación de la sustancia problema se suele rociar la superficie del suelo con la solución de ensayo. Todos los equipos utilizados para realizar los ensayos, incluidos los equipos utilizados para preparar y administrar la sustancia problema, deben ser tales en cuanto a su diseño y capacidad que los ensayos correspondientes puedan realizarse de una manera exacta y que se obtenga una cobertura reproducible. La cobertura debe ser uniforme en todas las superficies del suelo. Se debe tener cuidado para evitar la posibilidad de que las sustancias se adsorban o reaccionen con el equipo (por ejemplo, tubos de plástico y sustancias lipofílicas, o piezas y elementos de acero). Se rocía la sustancia problema en la superficie del suelo simulando las aplicaciones de un tanque de pulverización normal. Generalmente, los volúmenes rociados deben encontrarse en la banda de la práctica agrícola y volúmenes normales (cantidad de agua, etc.). El tipo de boquilla debe seleccionarse para proporcionar una cobertura uniforme de la superficie del suelo. En caso de que se apliquen disolventes y vehículos, debe establecerse un segundo grupo de plantas de control que reciban solo el disolvente o vehículo. Ello no es necesario en el caso de los productos fitosanitarios ensayados como formulaciones.
Verificación de la concentración/tasa de la sustancia problema
18.
Las concentraciones o tasas de aplicación deben confirmarse mediante una verificación analítica adecuada. En el caso de las sustancias solubles, la verificación de todas las concentraciones/tasas de ensayo puede confirmarse mediante el análisis de la concentración máxima de la solución de ensayo utilizada para el ensayo con documentación sobre la posterior dilución y la utilización de equipo de aplicación calibrado (por ejemplo, material analítico de vidrio, calibración del equipo rociador). En el caso de las sustancias insolubles, la verificación del material compuesto debe aportarse con los pesos de la sustancia problema añadidos al suelo. Si se requiere la demostración de la homogeneidad, puede ser necesario analizar el suelo.
PROCEDIMIENTO
Diseño del ensayo
19.
Se plantan en macetas semillas de la misma especie. El número de semillas plantadas por maceta dependerá de la especie, del tamaño de la maceta y de la duración del ensayo. El número de plantas por maceta debe proporcionar unas condiciones de crecimiento adecuadas y evitar la superpoblación durante todo el ensayo. La densidad de plantación máxima es de unas 3-10 semillas por 100 cm2, en función del tamaño de las semillas. Como ejemplo, se recomienda de una a dos plantas de maíz, soja, tomate, pepino o remolacha azucarera por recipiente de 15 cm; tres plantas de colza o guisantes por recipiente de 15 cm; y de cinco a diez plantas de cebolla, trigo, u otras semillas pequeñas por recipiente de 15 cm. El número de semillas y el de macetas replicadas (la réplica se define como una maceta, por lo que las plantas de una misma maceta no constituyen réplicas) deben ser adecuados para optimizar el análisis estadístico (21). Debe tenerse en cuenta que la variabilidad será mayor cuando se trate de especies de ensayo con un número menor de semillas grandes por maceta (réplica), en comparación con las especies de ensayo que permitan utilizar un mayor número de pequeñas semillas por maceta. Plantando un número igual de semillas en cada maceta esta variabilidad puede reducirse al mínimo.
20.
Se utilizan grupos de control para garantizar que los efectos observados están asociados con la exposición a la sustancia problema o se atribuyen solo a esta. El grupo de control adecuado debe ser idéntico al grupo de ensayo en todos los aspectos, salvo en la exposición a la sustancia problema. Todas las plantas de un mismo ensayo, incluidas las de los controles, deben proceder de la misma fuente. Para evitar que haya sesgo, es necesario que sea aleatoria la asignación de las macetas de ensayo y de control.
21.
Deben evitarse las semillas revestidas de insecticida o fungicida (es decir, las semillas tratadas). Sin embargo, algunas autoridades reguladoras permiten la utilización de determinados fungicidas de contacto no sistémicos (por ejemplo, captano, tiram) (22). Si se teme la presencia de patógenos transmitidos con las semillas, estas pueden bañarse brevemente en una solución de hipoclorito al 5 %, lavarse a continuación abundantemente con agua corriente y secarse. No se autoriza ningún tratamiento curativo con otro producto fitosanitario.
Condiciones del ensayo
22.
Las condiciones del ensayo deben aproximarse a las condiciones necesarias para el crecimiento normal de las especies y variedades utilizadas (en el apéndice 4 figuran algunos ejemplos de condiciones de ensayo). Las plantas emergentes deben mantenerse con buenas prácticas hortícolas en cámaras de ambiente controlado, invernaderos o fitotrones. Cuando se utilizan instalaciones de cultivo, estas prácticas suelen incluir el control y el registro con una frecuencia adecuada (como, p. ej., cada día) de la temperatura, la humedad, la concentración de dióxido de carbono, la luz (intensidad, longitud de onda, radiación activa para la fotosíntesis) y el fotoperíodo, los medios de riego, etc., para garantizar un buen crecimiento de las plantas, juzgado por el crecimiento de las plantas control de las especies seleccionadas. Conviene controlar la temperatura de los invernaderos mediante sistemas de ventilación, calefacción o refrigeración. Se recomiendan en general las siguientes condiciones para los ensayos en invernaderos:
—
temperatura: 22 °C ± 10 °C;
—
humedad: 70 % ± 25 %;
—
fotoperíodo: mínimo de 16 horas de luz;
—
intensidad luminosa: 350 ± 50 μE/m2/s. Puede ser necesario aportar una iluminación adicional si la intensidad desciende por debajo de 200 μE/m2/s, longitud de onda de 400 - 700 nm, excepto en caso de determinadas especies cuyas necesidades de luz sean inferiores.
Las condiciones ambientales deben ser objeto de seguimiento y notificación a lo largo de toda la duración del estudio. Las plantas deben cultivarse en macetas no porosas, de plástico o esmaltadas, con una bandeja o platillo debajo de la maceta. Es posible cambiar de posición las macetas periódicamente para minimizar la variabilidad en el crecimiento de las plantas (debida a las diferencias en las condiciones de ensayo en las instalaciones de cultivo). Las macetas deben ser bastante grandes para permitir un crecimiento normal.
23.
Pueden añadirse suplementos de nutrientes del suelo según sea necesario para mantener el vigor de las plantas. La necesidad y el calendario de la adición de nutrientes pueden evaluarse mediante la observación de las plantas de control. Se recomienda regar los recipientes de ensayo por el fondo (p. ej., mediante la utilización de mechas de fibra de vidrio). Sin embargo, puede utilizarse el riego superior al principio para estimular la germinación de las semillas y, en caso de aplicación de la sustancia en la superficie del suelo, para facilitar la introducción de la sustancia en el suelo.
24.
Las condiciones específicas de cultivo han de ser adecuadas para las especies ensayadas y la sustancia problema estudiada. Las plantas de control y las tratadas deben mantenerse en las mismas condiciones ambientales; no obstante, han de adoptarse medidas adecuadas para impedir la exposición cruzada (p. ej., de sustancias volátiles) entre los distintos grupos de tratamiento, así como la exposición de los controles a la sustancia problema.
Ensayo a concentración/tasa única
25.
A la hora de determinar la concentración/tasa adecuada de una sustancia para la realización de un ensayo a una concentración/tasa única (ensayo de tolerancia o límite), debe tenerse en cuenta una serie de factores. En relación con las sustancias en general, entre estos factores figuran las propiedades fisicoquímicas de la sustancia. En el caso de los productos fitosanitarios, hay que considerar las propiedades fisicoquímicas y el régimen de utilización de la sustancia problema, su concentración o tasa de aplicación máxima, el número de aplicaciones por temporada y/o la persistencia de la sustancia problema. Para determinar si una sustancia en general posee propiedades fitotóxicas, puede ser adecuado realizar un ensayo al nivel máximo de 1 000 mg/kg de suelo seco.
Ensayo de determinación del intervalo
26.
En caso necesario, puede realizarse un ensayo de determinación del intervalo para obtener información sobre las concentraciones o tasas que hayan de someterse a ensayo en el estudio definitivo de la relación dosis-respuesta. Para el ensayo de determinación del intervalo, las concentraciones o tasas de ensayo deben estar muy separadas entre sí (p. ej., 0,1, 1,0, 10, 100 y 1 000 mg/kg de suelo seco). En el caso de los productos fitosanitarios, las concentraciones o tasas podrían basarse en la concentración o tasa de aplicación recomendada o máxima; p, ej., 1/100, 1/10, 1/1 de ese valor.
Ensayo a concentración/tasa múltiple
27.
El objetivo del ensayo a concentración/tasa múltiple consiste en establecer la relación dosis-respuesta y determinar un valor de ECx o ERx relacionada con la emergencia, la biomasa y/o los efectos visibles frente a los controles sin exposición, según exijan las autoridades reguladoras.
28.
El número y el espaciado de las concentraciones o tasas deben ser suficientes para generar una relación dosis-respuesta y una ecuación de regresión fiables, y dar una estimación de los valores de ECx o ERx. Las concentraciones/tasas seleccionadas deben englobar los valores de ECx o ERx que haya que determinar. Por ejemplo, si se requiere un valor de EC50 sería aconsejable realizar el ensayo a tasas que produzcan un efecto de entre el 20 y el 80 %. El número recomendado de concentraciones/tasas de ensayo para conseguirlo es como mínimo de cinco en una serie geométrica más un control sin tratar, y espaciadas por un factor que no exceda de tres. Respecto a cada grupo de tratamiento y de control el número de réplicas debe ser como mínimo de cuatro y el número total de semillas, al menos de veinte. Puede ser necesario recurrir a más réplicas de determinadas plantas con un índice de germinación bajo o con hábitos de crecimiento variables, para aumentar la potencia estadística del ensayo. Si se utiliza un número mayor de concentraciones/tasas de ensayo, podrá reducirse el número de réplicas. Si ha de estimarse la NOEC, puede ser necesario utilizar más réplicas para obtener la potencia estadística deseada (23).
Observaciones
29.
Durante el período de observación, es decir, de 14 a 21 días desde el momento en que haya emergido el 50 % de las plantas de control (también del control de disolvente, en su caso), las plantas se examinan con frecuencia (al menos una vez por semana y, en la medida de lo posible, diariamente) para observar la emergencia, así como la fitotoxicidad visible y la mortalidad. Al final del ensayo, deben registrarse la medida del porcentaje de emergencia y la biomasa de las plantas supervivientes, así como los efectos nocivos visibles en diferentes partes de las plantas. Entre estos se incluyen las anomalías del aspecto de las plántulas emergidas, retraso en el crecimiento, clorosis, decoloración, mortalidad y efectos en el desarrollo de las plantas. La biomasa final puede medirse con la media del peso seco final de los brotes de las plantas supervivientes, obtenido recogiendo los brotes desde la superficie del suelo y secándolos, hasta llegar a peso constante, a 60 °C. Otra posibilidad es medir la biomasa final utilizando el peso fresco de los brotes. La altura de los brotes puede ser otro parámetro, si así lo requieren las autoridades reguladoras. Para evaluar las respuestas tóxicas observables, debe utilizarse un sistema uniforme de puntuación de las lesiones visibles. En las referencias (23) y (24) se dan ejemplos para la realización de las evaluaciones visuales cualitativas y cuantitativas.
DATOS E INFORME
Análisis estadístico
Ensayo a concentración/tasa única
30.
Los datos correspondientes a cada especie vegetal deben analizarse mediante un método estadístico adecuado (21). Debe registrarse el nivel del efecto a la concentración/tasa de ensayo, o bien la incapacidad de alcanzar un determinado efecto a la concentración/tasa de ensayo (por ejemplo, < x % de efecto observado a la concentración o tasa y).
Ensayo a concentración/tasa múltiple
31.
Se ha establecido una relación dosis-respuesta en términos de una ecuación de regresión. Pueden utilizarse modelos diferentes: por ejemplo, para estimar la ECx o ERx (p. ej., EC25, ER25, EC50, ER50) y sus límites de confianza en cuanto a la emergencia, pueden ser apropiados los métodos de datos cuánticos, de logit, de probit, de Weibull, de Spearman-Karber, de Spearman-Karber recortado, etc. En cuanto al crecimiento de las plántulas (peso y altura) como parámetros continuos, pueden estimarse los valores de ECx o ERx y sus límites de confianza utilizando un análisis de regresión adecuado [p. ej., el análisis de regresión no lineal de Bruce-Versteeg (25)]. Siempre que sea posible, el valor de R2 debe ser superior o igual a 0,7 para las especies más sensibles, y las concentraciones/tasas de ensayo utilizadas deben englobar los efectos del 20 % al 80 %. Si ha de estimarse la NOEC, debe preferirse la aplicación de ensayos estadísticos potentes y estos deben seleccionarse sobre la base de la distribución de los datos (21) (26).
Informe del ensayo
32.
El informe del ensayo debe presentar los resultados de los estudios, así como una descripción detallada de las condiciones de ensayo, una discusión exhaustiva de los resultados, el análisis de los datos y las conclusiones extraídas del análisis. Deben presentarse un cuadro sinóptico y un resumen de los resultados. El informe deberá incluir lo siguiente:
Sustancia problema:
—
datos de identificación de la sustancia, propiedades pertinentes de la sustancia estudiada (p. ej., log Pow, hidrosolubilidad, presión de vapor e información sobre el destino y el comportamiento en el medio ambiente, si se conocen);
—
datos sobre la preparación de la solución de ensayo y verificación de las concentraciones de ensayo según se especifica en el punto 18.
Especies de ensayo:
—
datos sobre el organismo de ensayo: especie/variedad, familia botánica, nombres científico y común, fuente y antecedentes de la semilla lo más detallados posible (es decir, nombre del proveedor, porcentaje de germinación, clase de tamaño de la semilla, número de lote, año o estación de recogida de la semilla, fecha de la determinación del índice de germinación, etc.);
—
número de especies de mono y dicotiledóneas utilizadas;
—
justificación de la selección de las especies;
—
descripción del almacenamiento, tratamiento y conservación de las semillas.
Condiciones de ensayo:
—
instalaciones de ensayo (por ejemplo, cámara de cultivo, fitotrón e invernadero);
—
descripción del sistema de ensayo (por ejemplo, dimensiones y material de las macetas, y cantidades de suelo);
—
características del suelo (o el tipo de textura del suelo: granulometría y clasificación del suelo, propiedades físicas y químicas, como el porcentaje de materia orgánica, porcentaje de carbono orgánico y pH);
—
preparación del suelo o sustrato (p. ej., suelo, suelo artificial, arena y otros) antes del ensayo;
—
descripción del medio nutritivo, en caso de utilizarse;
—
aplicación de la sustancia problema: descripción del método de aplicación, descripción del equipo, tasas de exposición y volúmenes, incluida la verificación química, descripción del método de calibración y descripción de las condiciones ambientales durante la aplicación;
—
condiciones de cultivo: intensidad luminosa (p. ej., radiación correspondiente a la fotosíntesis), fotoperíodo, temperaturas máxima y mínima, régimen y método de riego, fertilización;
—
número de semillas por maceta, número de plantas por dosis, número de réplicas (macetas) por tasa de exposición;
—
tipo y número de controles (controles positivos y/o negativos, control de disolvente en su caso);
—
duración del ensayo.
Resultados:
—
cuadro de todos los parámetros correspondientes a cada réplica, concentración/tasa de ensayo y especie;
—
número y porcentaje de emergencias en comparación con los controles;
—
mediciones de la biomasa (peso seco o peso fresco de los brotes) de las plantas como porcentaje de la de los controles;
—
altura de los brotes como porcentaje de la de los controles, si se ha medido;
—
porcentaje de las lesiones visibles y descripción cuali y cuantitativa de las lesiones visibles (clorosis, necrosis, marchitamiento, deformación de hojas y tallos, así como eventual ausencia de efectos) causadas por la sustancia problema en comparación con las plantas de control;
—
descripción de la escala de clasificación utilizada para evaluar las lesiones visibles, si se facilita una clasificación visual;
—
en caso de estudios a tasa única, debe indicarse el porcentaje de lesiones;
—
valores de ECx o ERx (p. ej., EC50, ER50, EC25, ER25) y límites de confianza correspondientes; cuando se hace un análisis de regresión, debe aportarse el error típico de la ecuación de regresión, y el error típico de la estimación de los parámetros individuales (p. ej., pendiente, ordenada en el origen);
—
valores de LOEC y NOEC si se calculan;
—
descripción de los procedimientos estadísticos y de las hipótesis utilizadas;
—
representación gráfica de dichos datos y de la relación dosis-respuesta de las especies estudiadas;
desviaciones de los procedimientos descritos en el presente método de ensayo y de cualquier acontecimiento inusual ocurrido en el ensayo.
BIBLIOGRAFÍA
(1)
Schrader G., Metge K. and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193.
(2)
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(3)
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(5)
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(6)
US EPA (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines:
—
850.4000: Background — Non-target Plant Testing;
—
850.4025: Target Area Phytotoxicity;
—
850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence);
—
850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test;
—
850.4225: Seedling Emergence, Tier II;
—
850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test.
(7)
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(26)
Capítulo C.33 del presente anexo: Ensayo de reproducción de lombrices de tierra (Eisenia fetida / Eisenia andrei).
Apéndice 1
Definiciones
Principio activo (p.a.) [o sustancia activa (s.a.)] : material diseñado para proporcionar un efecto biológico específico (por ejemplo, lucha contra los insectos, lucha contra enfermedades vegetales, lucha contra las malas hierbas en la zona de tratamiento), también conocido como principio activo o sustancia activa de grado técnico.
Sustancia : sustancia o mezcla.
Productos fitosanitarios (PFS) o plaguicidas : materiales con una determinada actividad biológica que se utilizan intencionadamente para proteger los cultivos contra las plagas (p. ej., contra enfermedades fúngicas, insectos, y plantas competitivas).
ECx, concentración con efecto al x %, o ERx, tasa con efecto al x % : concentración o tasa que provoca un cambio o alteración indeseable del x % en el parámetro de ensayo que se mide, en relación con el control (p. ej., una reducción del 25 % o 50 % en la emergencia de las plántulas, en el peso de los brotes, en el número final de plantas presentes, o un aumento de las lesiones visibles en esos porcentajes se corresponderían con una EC25/ER25 o EC50/ER50 respectivamente).
Emergencia : aparición del coleóptilo o cotiledón por encima de la superficie del suelo.
Formulación : producto formulado comercial que contiene la sustancia activa (principio activo), también conocido como preparado final (8) o producto típico de uso final.
Concentración mínima con efecto observado (LOEC) : concentración más baja de la sustancia problema a la que se observa un efecto. En este ensayo, la concentración correspondiente a la LOEC tiene un efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro de un determinado período de exposición en comparación con el control, y es superior al valor de NOEC.
Plantas no diana : plantas que se encuentran fuera de la zona de las plantas diana. En el caso de los productos fitosanitarios, esta denominación se refiere en general a las plantas que se encuentran fuera de la zona de tratamiento.
Concentración sin efecto observado (NOEC) : concentración más elevada de la sustancia problema a la que no se observa ningún efecto. En este ensayo, la concentración correspondiente a la NOEC no ejerce ningún efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro de un determinado período de exposición en comparación con el control.
Fitotoxicidad : desviaciones perjudiciales (detectadas por medición y por evaluación visual) respecto al modelo normal de aspecto y de crecimiento de las plantas, en respuesta a una sustancia determinada.
Réplica : unidad experimental que representa al grupo de control o al grupo de tratamiento. En estos estudios, la maceta se define como la réplica.
Evaluación visual : calificación de las lesiones visibles según las observaciones del porte, vigor, malformaciones, clorosis, necrosis y aspecto general de las plantas, en comparación con un control.
Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.
Apéndice 2
Lista de especies utilizadas tradicionalmente en el ensayo de plantas
Familia
Especie
Denominación común
DICOTYLEDONAE
Apiaceae (Umbelliferae)
Daucus carota
Zanahoria
Asteraceae (Compositae)
Helianthus annuus
Girasol
Asteraceae (Compositae)
Lactuca sativa
Lechuga
Brassicaceae (Cruciferae)
Sinapis alba
Mostaza blanca
Brassicaceae (Cruciferae)
Brassica campestris, var. chinensis
Col de China
Brassicaceae (Cruciferae)
Brassica napus
Colza
Brassicaceae (Cruciferae)
Brassica oleracea var. capitata
Col
Brassicaceae (Cruciferae)
Brassica rapa
Nabo
Brassicaceae (Cruciferae)
Lepidium sativum
Mastuerzo
Brassicaceae (Cruciferae)
Raphanus sativus
Rábano
Chenopodiaceae
Beta vulgaris
Remolacha azucarera
Cucurbitaceae
Cucumis sativus
Pepino
Fabaceae (Leguminosae)
Glycine max (G. soja)
Soja
Fabaceae (Leguminosae)
Phaseolus aureus
Judía mung
Fabaceae (Leguminosae)
Phaseolus vulgaris
Judía enana, alubia, habichuela
Fabaceae (Leguminosae)
Pisum sativum
Guisante
Fabaceae (Leguminosae)
Trigonella foenum-graecum
Fenogreco
Fabaceae (Leguminosae)
Lotus corniculatus
Loto de los prados
Fabaceae (Leguminosae)
Trifolium pratense
Trébol violeta
Fabaceae (Leguminosae)
Vicia sativa
Veza
Linaceae
Linum usitatissimum
Lino
Polygonaceae
Fagopyrum esculentum
Alforfón
Solanaceae
Solanum lycopersicum
Tomate
MONOCOTYLEDONAE
Liliaceae (Amarylladaceae)
Allium cepa
Cebolla
Poaceae (Gramineae)
Avena sativa
Avena
Poaceae (Gramineae)
Hordeum vulgare
Cebada
Poaceae (Gramineae)
Lolium perenne
Ballico
Poaceae (Gramineae)
Oryza sativa
Arroz
Poaceae (Gramineae)
Secale cereale
Centeno
Poaceae (Gramineae)
Sorghum bicolor
Sorgo de grano, caña dulce
Poaceae (Gramineae)
Triticum aestivum
Trigo
Poaceae (Gramineae)
Zea mays
Maíz
Apéndice 3
Lista de posibles especies no cultivadas
Posibles especies según la OCDE para los ensayos de toxicidad con plantas
Nota: El cuadro siguiente ofrece información sobre 52 especies no cultivadas (las referencias para cada entrada figuran entre paréntesis). Las tasas de emergencia indicadas son datos publicados en la bibliografía, y solo tienen valor orientativo general. La experiencia individual puede variar en función del origen de las semillas y de otros factores.
FAMILIA Nombre botánico de la especie
(nombre común en español)
Duración de vida (9) y hábitat
Peso de la semilla
(mg)
Fotoperíodo para la germinación o el crecimiento (10)
Profundidad de la plantación
(mm) (11)
Tiempo para la germinación
(días) (12)
Tratamientos especiales (13)
Ensayo de toxicidad (14)
Proveedores de las semillas (15)
Otras referencias (16)
APIACEAE
Torilis japonica
(cachurro)
А, В Zonas alteradas, setos, pastizales (16, 19)
1,7 - 1,9 (14, 19)
L = D (14)
0
(1, 19)
5 (50 %) (19)
Estratificación en frío (7, 14, 18, 19) Puede ser necesaria una fase de maduración (19) Germinación inhibida por la oscuridad (1, 19) Sin tratamientos especiales (5)
POST (5)
ASTERACEAE
Bellis perennis
(margarita)
Ρ
Pastos, tierras de labor, turba (16, 19)
0,09 - 0,17 (4, 19)
L = D (14)
0
(4)
3 (50 %) (19)
11 (100 %) (18)
Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (18, 19) Sin tratamientos especiales (4, 14)
POST (4)
A, D, F
7
Centaurea cyanus
(aciano)
A
Campos, cunetas, hábitats abiertos (16)
4,1 - 4,9 (4, 14)
L = D (14)
0 - 3 (2, 4, 14)
14 - 21 (100 %) (14)
Sin tratamientos especiales (2, 4)
POST (2, 4)
A, D, E, F
7
Centaurea nigra
(aciano negro)
Ρ
Campos, cunetas, hábitats abiertos (16, 19)
2,4 - 2,6 (14, 19)
L = D (14)
0 (19)
3 (50 %) (19)
4 (97 %) (18)
Puede ser necesaria una fase de maduración (18, 19) Germinación inhibida por la oscuridad (19) Sin tratamientos especiales (5, 14, 26)
POST (5, 22, 26)
A
Inula helenium
(helenio)
Ρ
Lugares húmedos, alterados
(16)
1 - 1,3 (4, 14, 29)
0
(4, 29)
Sin tratamientos especiales (4)
POST (4)
A, F
Leontodon hispidus
(diente de león hirsuto)
Ρ
Campos, cunetas, zonas alteradas (16, 19)
0,85 - 1,2 (14, 19)
L = D (14)
0 (19)
4 (50 %) (19)
7 (80 %) (18)
Germinación inhibida por la oscuridad (17, 18, 19) Sin tratamientos especiales (5, 23)
POST (5, 22, 23)
Rudbeckia hirta
(rudbeckia velluda)
Β, Ρ Zonas alteradas
(16)
0,3 (4, 14)
L = D (14)
0
(4, 33)
< 10 (100 %) (33)
Sin tratamientos especiales
(4, 14, 33)
POST (4, 33)
C, D, E, F
Solidago canadensis
(vara de oro canadiense)
Ρ
Pastizales, zonas abiertas (16)
0,06 -0,08 (4, 14)
L = D (11)
0
(4)
14 - 21
(11)
Mezclar con la misma cantidad de arena y empapar en GA de 500 ppm durante 24 horas (11) Sin tratamientos especiales (4)
POST (4)
E, F
Xanthium pensylvanicum
(abrojo)
A
Campos, hábitats abiertos (16)
25 - 61 (14, 29)
0 (1)
5 (29)
La germinación puede verse inhibida por la oscuridad (1) Bañar en agua caliente durante 12 horas (29)
PRE Y POST (31)
A
Xanthium spinosum
(abrojillo)
A
Hábitats abiertos (16)
200 (14)
L = D (14)
L > D (6)
10
(6)
Escarificación (14) Sin tratamientos especiales (6)
PRE Y POST (6)
A
Xanthium strumarium
(bardana)
A
Campos, hábitats abiertos (16)
67,4 (14)
L = D (14)
10 - 20 (6, 21)
Sin tratamientos especiales
(6, 14, 21)
PRE Y POST (6, 21, 28, 31)
A
BRASSICACEAE
Cardamine pratensis
(berro de prado)
Ρ
Campos, cunetas, turba (16, 19)
0,6 (14, 19)
L = D (14)
0 (19)
5 (50 %) (19)
15 (98 %) (18)
Germinación inhibida por la oscuridad (8, 19) Sin tratamientos especiales (5, 14, 22)
POST (5, 22)
F
CARYOPHYLLACEAE
Lychnis flos-cuculi
(flor de cuclillo)
Ρ
(16)
0,21 (14)
L = D (14)
< 14 (100 %) (14, 25)
Puede ser necesaria una fase de maduración (18) Sin tratamientos especiales (5, 14, 15, 22 - 26)
POST (5, 15, 22 - 26)
F
CHENOPODIACEAE
Chenopodium album
(cenizo)
A
Lindes de campos, zonas alteradas (16, 19)
0,7 - 1,5 (14, 19, 34)
L = D (14)
0
(1, 19)
2 (50 %) (19)
El tratamiento depende del color de la semilla (19) Dormancia en almacenamiento seco (19) Germinación inhibida por la oscuridad (1, 18, 19) Estratificación en frío (18) Sin tratamiento especial (14, 34)
PRE Y POST (28, 31, 34)
A
32
CLUSIACEAE
Hypericum perforatum
(hipérico)
Ρ
Campos, tierras de labor, hábitats abiertos (16, 19)
0,1 - 0,23
(14, 19)
L = D
(14)
0
(1, 19)
3 (19)
11 (90 %) (18)
Germinación inhibida por la oscuridad (1, 18, 19)
Sin tratamientos especiales (5, 14, 15, 25, 27)
POST
(5, 15, 25, 27)
A, E, F
CONVOLVULACEAE
Ipomoea hederacea
(trompillo)
A
Cunetas, hábitats abiertos, campos de maíz (16)
28,2
(14)
L > D
(6, 10)
10 - 20
(6, 10, 21)
4 (100 %)
(10)
Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1)
Sin tratamientos especiales (6, 21)
PRE Y POST
(6, 12, 21, 28)
A
CYPERACEAE
Cyperus rotundus
(coquito)
Ρ
Tierras de labor, pastizales, cunetas (16, 30)
0,2
(14)
L = D
(14)
0 (1)
10 - 20 (6, 10)
12 (91 %)
(10)
Germinación inhibida por la oscuridad (1)
Sin tratamientos especiales (6, 10, 14)
PRE Y POST
(6, 28, 31)
B
7
FABACEAE
Lotus corniculatus
(cuernecillo)
Ρ
Herbazales, cunetas, hábitats abiertos (16, 19)
1 - 1,67
(14, 19)
L = D (14)
1 (50 %)
(19)
Escarificación (14, 19)
Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (18, 19) Sin tratamientos especiales (23, 25)
POST
(5, 23, 25)
A, D, E, F
Senna obtusifolia
(hediondillo)
A
Bosques húmedos (16)
23 - 28
(9)
L = D (14)
L > D (9)
10 - 20
(6, 9)
Bañar las semillas en agua durante 24 horas (9)
Escarificación (14) La viabilidad de las semillas depende del color (1) Sin tratamientos especiales (6)
POST
(6, 9)
A
Sesbania exaltata
(cáñamo)
A
Suelos aluviales (16)
11 - 13
(9, 14)
L > D (9)
10 - 20
(9, 21)
Bañar las semillas en agua durante 24 horas (9)
Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (18, 1) Sin tratamientos especiales (21)
PRE Y POST
(9, 21, 28, 31)
A
Trifolium pratense
(trébol rojo)
Ρ
Campos, cunetas, tierras de labor (16, 19)
1,4 - 1,7
(14, 19)
L = D (14)
1 (50 %)
(19)
Escarificación (14, 18)
Puede ser necesaria una fase de maduración (19) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1, 19) Sin tratamientos especiales (5)
POST
(5)
A, E, F
LAMIACEAE
Leonurus cardiaca
(agripalma)
Ρ
Zonas abiertas (16)
0,75 - 1,0
(4, 14)
L = D (14)
0
(4)
Sin tratamientos especiales
(4, 14)
POST
(4)
F
Mentha spicata
(hierbabuena)
Ρ
Zonas húmedas (16)
2,21
(4)
0
(4)
Sin tratamientos especiales
(4)
POST
(4)
F
Nepeta cataria
(hierba gatera)
Ρ
Zonas alteradas (16)
0,54
(4, 14)
L = D (14)
0
(4)
Sin tratamientos especiales
(2, 4, 14)
POST
(2, 4)
F
Prunella vulgaris
(consuelda menor)
Ρ
Tierras de labor, herbazales, lugares alterados (16, 19)
0,58 -1,2
(4, 14, 19)
L = D (14)
0
(4, 19)
5 (50 %) (19)
7 (91 %) (18)
Germinación inhibida por la oscuridad (18, 19)
Germinación mejor con semillas mayores (1) Sin tratamientos especiales (4, 14, 22)
POST
(4, 22)
A, F
Stachys officinalis
(betónica)
Ρ
Prados, lindes de campos (19)
14 - 18
(14, 19)
L = D (14)
7 (50 %)
(19)
Sin tratamientos especiales
(5, 14, 22)
POST
(5, 22)
F
MALVACEAE
Abutilon theophrasti
(abutilón)
A
Campos, hábitats abiertos (16)
8,8
(14)
L = D (14)
10 - 20
(6, 10, 21)
4 (84 %)
(10)
Escarificación (14)
Sin tratamientos especiales (5, 10, 21)
PRE Y POST
(6, 22, 28, 31)
A, F
Sida spinosa
(malva de caballo)
A
Campos, cunetas (16)
3,8
(14)
L = D (14)
10 - 20
(6, 21)
Escarificación (14)
Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1) Sin tratamientos especiales (6, 21)
PRE Y POST
(6, 21, 28, 31)
A, F
PAPAVERACEAE
Papaver rhoeas
(amapola)
A
Campos, tierras de labor, lugares alterados (16, 19)
0,1 - 0,3
(4, 14, 19, 29)
L = D (14)
0
(4, 29)
4 (50 %)
(19)
Estratificación en frío y escarificación (1, 19, 32)
Sin tratamientos especiales (4, 14, 29)
POST
(4)
A, D, E, F, G
POACEAE
Agrostis tenuis
(agróstide común)
Céspedes, pastizales (16)
0,07 (14)
L > D (Ю)
20 (10)
10 (62 %) (10)
Germinación inhibida por la oscuridad (1, 17 - 19) Sin tratamientos especiales (10)
POST (10)
A, E
Alopecurus myosuroides
(cola de zorra)
A
Campos, hábitats abiertos (16)
0,9 - 1,6
(29, 34)
L = D (14)
2
(29)
< 24 (30 %) (34)
Escarificación (14) Tratar con 101 mg/l KNO3 (14) Estratificación en caliente (1) Germinación inhibida por la oscuridad (1) Sin tratamientos especiales (34)
PRE Y POST
(28, 34)
A
32
Avena fatua
(ballueca)
A
Zonas cultivadas, hábitats abiertos (16)
7 - 37,5 (14, 30)
L = D (14)
L > D (6)
10 - 20 (6, 10)
3 (70 %) (18)
Escarificación (7, 32) Germinación inhibida por la oscuridad (1)
Estratificación en frío (1, 18) Sin tratamientos especiales (6, 10, 14)
PRE Y POST (6, 10, 28, 31)
A
Bromus tectorum
(espiguilla colgante)
A
Campos, cunetas, tierras de labor (16)
0,45 - 2,28 (14, 29)
L = D (14)
3 (29)
Período de maduración (1, 7, 32) Germinación inhibida por la oscuridad (1) Sin tratamientos especiales (14)
PRE Y POST (28, 31)
A
Cynosurus cristatus
(cola de perro)
P
Campos, cunetas, hábitats abiertos (16, 19)
0,5 - 0,7 (14, 19, 29)
L = D (14)
0 (29)
3 (50 %) (19)
Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (19) Sin tratamientos especiales (14, 29)
POST (5)
A
Digitaria sanguinalis
(garranchuela)
A
Campos, turba, hábitats abiertos (16)
0,52 - 0,6 (14, 30)
L = D (14)
10 - 20 (21)
7 (75 %)
14 (94 %) (7)
Escarificación, estratificación en frío y maduración (1, 7, 14, 32) Tratar con 101 mg/l KNO3 (14) Germinación inhibida por la oscuridad (1) Sin tratamientos especiales (21)
PRE Y POST (18, 25, 31)
A
Echinochloa crusgalli
(mijera)
A
(16)
1,5 (14)
L = D (14)
L > D (3)
10 - 20 (7, 21)
Escarificación (7, 32) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1) Sin tratamientos especiales (3, 14, 21)
PRE Y POST (3, 21, 28, 31)
A
Elymus canadensis
(zacate silvestre de Canadá)
P
Lugares ribereños, alterados (16)
4 - 5 (14, 30)
L = D (11)
1
(11)
14 - 28
(11)
Sin tratamientos especiales
(2, 11)
POST (2)
C, D, E
Festuca pratensis
(cañuela)
P
Campos, zonas húmedas (16, 19)
1,53 - 2,2 (16, 19)
L = D (14)
L > D (10)
20 (10)
9 (74 %) (10)
2 (50 %) (19)
Sin tratamientos especiales
(10, 19)
POST (10)
A
7
Hordeum pusillum
(cola de zorro)
A
Pastizales, cunetas, hábitats abiertos (16)
3,28 (14)
Estratificación en caliente (1) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1)
PRE (31)
7
Phleum pratense
(fleo de los prados)
P
Pastizales, tierras de labor, lugares alterados (16, 19)
0,45 (14, 19)
L > D (10, 14)
0 - 10 (10, 19)
2 (74 %) (10)
8 (50 %) (19)
Germinación inhibida por la oscuridad (19) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (17) Sin tratamientos especiales (10, 14, 17, 19)
POST (10)
A, E
POLYGONACEAE
Polygonum convolvulus
(polígono trepador)
A
Hábitats abiertos, cunetas (16)
5 - 8 (4, 14, 29)
L = D (20)
0 - 2 (4, 29)
Estratificación en frío durante 4-8 semanas (1, 2, 4, 20, 29) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1)
PRE Y POST (1, 2, 20, 28, 31)
A
32
Polygonum lapathifolium
(hierba pejiguera)
A
Suelos húmedos (16)
1,8 - 2,5 (14)
L > D (6)
5 (94 %) (18)
Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1) Germinación inhibida por la oscuridad (18) Estratificación en frío (1) Sin tratamientos especiales (5)
PRE Y POST (6)
A, E
Polygonum pennsylvanicum
(polígono de Pennsylvania)
A
Campos, hábitats abiertos (16)
3,6 - 7 (14, 29)
2 (29)
Estratificación en frío durante 4 semanas a 0 - 5 °C (1, 29) Germinación inhibida por la oscuridad (1)
PRE (31)
A, E
Polygonum persicaria
(persicaria)
A
Zonas alteradas, tierras de labor (16, 19)
2,1 - 2,3 (14, 19)
L > D (13)
0 (19)
< 14 (13)
2 (50 %) (19)
Escarificación, estratificación en frío, tratamiento con GA (14) Estratificación en frío, maduración (17 - 19) Germinación inhibida por la oscuridad (19) Sin tratamientos especiales (13)
POST (13)
A
32
Rumex crispus
(acedera)
P
Tierras de labor, cunetas, zonas abiertas (16, 19)
1,3 - 1,5 (4, 14, 19)
L = D (14, 33)
0
(4, 19, 33)
3 (50 %) (19)
6 (100 %) (33)
Germinación inhibida por la oscuridad (18, 19) Puede ser necesaria una fase de maduración (18) Sin tratamientos especiales (4, 14, 33)
POST (4, 33)
A, E
32
PRIMULACEAE
Anagallis arvensis
(anagálide)
A
Tierras de labor, herbazales, lugares alterados (16, 19)
0,4 - 0,5 (4, 14, 19)
L = D (14)
1 (50 %) (19)
Estratificación en frío, tratamiento con GA (1,14, 18, 19, 32) Luz necesaria para la germinación (1) Sin tratamientos especiales (2, 4)
POST (2,4)
A, F
RANUNCULACEAE
Ranunculus acris
(botón de oro)
Ρ
Tierras de labor, cunetas, zonas abiertas (16, 19)
1,5 - 2 (14, 19, 29)
L = D (14)
1
(29)
41 - 56 (19, 29)
Sin tratamientos especiales
(5, 14, 22, 24 - 26)
POST (5, 22, 24 - 26)
32
ROSACEAE
Geum urbanum
(hierba de San Benito)
Ρ
Setos, zonas húmedas
(16, 19)
0,8 - 1,5 (14, 19)
L = D (14)
0 (19)
5 (50 %) (19)
16 (79 %) (18)
Germinación inhibida por la oscuridad (18, 19) Estratificación en caliente (1) Sin tratamientos especiales (5, 14, 22, 25, 26)
POST (5, 22, 25, 26)
A
RUBIACEAE
Galium aparine
(amor de hortelano)
A
Tierras de labor, zonas húmedas, lugares alterados (16, 19)
7 - 9 (14, 19)
L = D (14)
5 (50 %) (19)
6 (100 %) (18)
Estratificación en frío (1, 18, 19) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (18, 19) La luz inhibe la germinación (1) Sin tratamientos especiales (6, 14)
PRE Y POST (6, 28)
A
32
Galium mollugo
(galio blanco)
Ρ
Setos en taludes, zonas abiertas (8)
7
(29)
L = D (14)
2
(29)
Sin tratamientos especiales
(5, 14, 22, 24, 26, 29)
POST (5, 22, 24, 26)
A
SCROPHULARIACEAE
Digitalis purpurea
(digital)
Ρ, Β Setos, zonas abiertas (16, 19)
0,1 - 0,6 (4, 14, 19)
L = D (14)
0
(4, 19)
6 (50 %) (19)
8 (99 %) (18)
Germinación inhibida por la oscuridad (1, 17, – 19) Sin tratamientos especiales (4, 22 - 26)
POST (4, 22 - 26)
D, G, F
Veronica persica
(verónica)
A
Tierras de labor, zonas abiertas, lugares alterados (16, 19)
0,5 - 0,6 (14, 19)
L = D (14)
0 (19)
3 (19)
5 (96 %) (18)
Germinación inhibida por la oscuridad (18, 19) Estratificación en frío (18) Sin tratamientos especiales (14)
PRE Y POST (28)
A
32
Proveedores de semillas citados
Identidad del proveedor
Información del proveedor
A
Herbiseed
New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ Reino Unido + 44 (0) 1189 349 464
www.herbiseed.com
B
Tropilab Inc.
8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 Estados Unidos
(727) 344 - 4050
www.tropilab.com
C
#316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 Canadá (519) 586 — 3985
D
Applewood Seed Co.
5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 Estados Unidos (303) 431 - 7333
www.applewoodseed.com
E
Ernst Conservation Seeds
9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 Estados Unidos
(800) 873 - 3321
www.ernstseed.com
F
Chiltern Seeds
Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB Reino Unido
+ 44 1229 581137
www.chiltemseeds.co.uk
G
P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 Canadá (800) 274 - 7333
www.thompson-morgan.com
REFERENCIAS CITADAS:
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Comunicación personal. (www.ernstseed.com)
(12)
(13)
(14)
Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid)
(15)
(16)
(17)
Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558.
(18)
(19)
(20)
Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453-459.
(21)
(22)
(23)
(24)
(25)
(26)
(27)
(28)
(29)
Morton, S. (Herbiseed). 2004. Comunicación personal. (http://www.herbiseed.com)
(30)
USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 Estados Unidos.
(31)
US EPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch].
(32)
Webster, R. H., 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford.
(33)
(34)
Apéndice 4
Ejemplos de condiciones adecuadas de cultivo para determinadas especies cultivadas
Las siguientes condiciones se han considerado idóneas para diez especies cultivadas, y pueden utilizarse como orientación para los ensayos en cámaras de cultivo también con otras especies determinadas:
Concentración de dióxido de carbono: 350 ± 50 ppm;
Humedad relativa: 70 ± 5 % durante los períodos de luz y 90 ± 5 % durante los períodos de oscuridad;
Temperatura: 25 ± 3 °C por el día, 20 ± 3 °C por la noche;
Fotoperíodo: 16 horas de luz / 8 horas de oscuridad, partiendo de una media de longitud de onda de 400 a 700 nm;
Luz: luminancia de 350 ± 50 μE/m2/s, medida en lo más alto del follaje.
Las especies cultivadas son las siguientes:
—
tomate (Solanum lycopersicum);
—
pepino (Cucumis sativus);
—
lechuga (Lactuca sativa);
—
soja (Glycine max);
—
col (Brassica oleracea var. capitata)
—
zanahoria (Daucus carota);
—
avena (Avena sativa);
—
ballico (Lolium perenne);
—
maíz (Zea mays);
—
cebolla (Allium cepa).
C.32. ENSAYO DE REPRODUCCIÓN DE ENQUITREIDOS
INTRODUCCIÓN
1.
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 220 (2004). Está diseñado para utilizarse en la evaluación de los efectos de las sustancias sobre el resultado reproductor del gusano enquitreido, Enchytraeus albidus, Henle 1873, en el suelo. Se basa principalmente en un método desarrollado por el Umweltbundesamt de Alemania (1), que ha sido objeto de un ensayo interlaboratorios (2). También se han considerado otros métodos de ensayo de la toxicidad de las sustancias para los enquitreidos y las lombrices de tierra (3) (4) (5) (6) (7) (8).
CONSIDERACIONES INICIALES
2.
Los anélidos que viven en el suelo del género Enchytraeus son, desde el punto de vista ecológico, especies pertinentes para ensayos ecotoxicológicos. Si bien los enquitreidos se encuentran a menudo en los suelos que contienen lombrices de tierra, también es cierto que suelen abundar en muchos suelos de los que están ausentes las lombrices de tierra. Los enquitreidos puede utilizarse en pruebas de laboratorio, así como en estudios de semicampo y de campo. Desde un punto de vista práctico, muchas especies de Enchytraeus son fáciles de manejar y criar, y su tiempo de generación es considerablemente menor que el de las lombrices de tierra. La duración de un ensayo de reproducción con enquitreidos es, por tanto, de solo 4 - 6 semanas, mientras que con lombrices de tierra (Eisenia fetida) es de 8 semanas.
3.
Puede encontrarse información básica sobre la ecología y la ecotoxicología de los enquitreidos en el medio ambiente terrestre en las referencias (9) (10) (11) (12).
PRINCIPIO DEL ENSAYO
4.
Se exponen enquitreidos adultos a un intervalo de concentraciones de la sustancia problema mezclada con un suelo artificial. El ensayo puede dividirse en dos fases: a) un ensayo de determinación del intervalo, en caso de que no se disponga de suficiente información, en el que la mortalidad es el principal parámetro evaluado tras dos semanas de exposición, y b) un ensayo definitivo de reproducción, en el que se evalúan el número total de juveniles producidos por un animal padre y la supervivencia de los animales padres. La duración del ensayo definitivo es de seis semanas. Tras las tres primeras semanas se extraen las lombrices adultas y se registran los cambios morfológicos. Después de un período adicional de tres semanas, se cuenta el número de descendientes, nacidos de los capullos producidos por los adultos. El resultado reproductor de los animales expuestos a la sustancia problema se compara con el del control o controles a fin de determinar i) la concentración sin efecto observado (NOEC) y/o ii) una ECx (p. ej., EC10, EC50) aplicando un modelo de regresión para estimar la concentración que causaría una reducción del x % del resultado reproductor. Las concentraciones de ensayo deben englobar la ECx (p. ej., EC10, EC50) de forma que el valor de ECx se obtenga por interpolación y no por extrapolación.
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA
5.
Es preferible conocer la hidrosolubilidad, el log Kow, el coeficiente de reparto agua/suelo (véase, por ejemplo, el capítulo C.18 o C.19 del presente anexo) y la presión de vapor de la sustancia problema. Es conveniente disponer de información adicional sobre el destino de la sustancia problema en el suelo, tal como las velocidades de hidrólisis y de fotólisis.
6.
Este método de ensayo puede utilizarse para sustancias tanto solubles como insolubles en agua. Sin embargo, el modo de aplicación de la sustancia problema variará en consecuencia. El método de ensayo no es aplicable a las sustancias volátiles, es decir, sustancias cuya constante de Henry o cuyo coeficiente de reparto aire/agua sea superior a uno, o sustancias cuya presión de vapor a 25 °C supere los 0,0133 Pa.
VALIDEZ DEL ENSAYO
7.
Para que el ensayo sea válido, los controles deben cumplir los criterios de comportamiento siguientes:
—
la mortalidad de adultos no debe ser superior al 20 % al final del ensayo de determinación del intervalo y después de las tres primeras semanas del ensayo de reproducción;
—
en el supuesto de que se utilicen diez adultos por recipiente en el diseño del ensayo, debe haberse producido al final del ensayo una media de al menos veinticinco juveniles por recipiente;
—
el coeficiente de variación alrededor del número medio de juveniles no debe ser superior al 50 % al final del ensayo de reproducción.
Cuando un ensayo no cumpla los criterios de validez arriba indicados, el ensayo debe interrumpirse, salvo que pueda aportarse una justificación para continuar con él. La justificación deberá incluirse en el informe.
SUSTANCIA DE REFERENCIA
8.
Es necesario someter a ensayo una sustancia de referencia a intervalos regulares, o bien incluirla en cada ensayo, para verificar que la respuesta de los organismos de ensayo no ha cambiado de forma significativa a lo largo del tiempo. La carbendazima es una sustancia de referencia adecuada de la que se ha visto que afecta a la supervivencia y reproducción de los enquitreidos (13) (14), pero pueden utilizarse otras sustancias cuyos datos de toxicidad sean bien conocidos. En un ensayo interlaboratorios se utilizó una formulación de carbendazima conocida por el nombre comercial de Derosal™, suministrada por AgrEvo Company (Francfort, Alemania) y que contiene 360 g/l de principio activo (32,18 %) (2). La EC50 para la reproducción determinada en la prueba interlaboratorios era del orden de 1,2 ± 0,8 mg de principio activo (p. a.) por kg de masa seca (2). Si se incluye un patrón tóxico positivo en la serie de ensayo, se utiliza una sola concentración y el número de réplicas debe ser el mismo que el de los controles. Por lo que respecta a la carbendazima, se recomienda el ensayo de 1,2 mg p. a./kg de peso seco (ensayo con la formulación líquida).
DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO
Equipo
9.
Los recipientes de ensayo serán de vidrio o de otro material químicamente inerte. Son adecuados los frascos de vidrio (por ejemplo, volumen: 0,20 - 0,25 litros; diámetro: ≈ 6 cm). Deben disponer de tapas transparentes (por ejemplo, de vidrio o de polietileno) diseñadas de forma que se reduzca la evaporación, pero permitiendo al mismo tiempo el intercambio de gases entre el suelo y la atmósfera. Las tapas deben ser transparentes para permitir la transmisión de la luz.
10.
Se precisa el equipo normal de laboratorio y, en particular, el siguiente:
—
estufa secadora;
—
microscopio estereoscópico;
—
pH-metro y fotómetro;
—
balanzas exactas adecuadas;
—
equipo adecuado para el control de la temperatura;
—
equipo adecuado para el control de la humedad (no esencial si los recipientes de exposición tienen tapa);
—
incubadora o pequeña sala con aire acondicionado;
—
pinzas, ganchos o asas;
—
cubeta de revelado fotográfico.
Preparación del suelo artificial
11.
En este ensayo se utiliza un suelo artificial (5) (7) con la siguiente composición (en peso seco, secado hasta peso constante a 105 °C):
—
10 % de turba esfágnea, secada al aire y finamente molida (es aceptable un tamaño de partícula de 2 ± 1 mm); antes de su utilización en un ensayo, es recomendable comprobar que un suelo elaborado con un nuevo lote de turba es adecuado para el cultivo de lombrices;
—
20 % de caolín, con un contenido de caolinita preferentemente superior al 30 %;
—
aproximadamente entre 0,3 y 1,0 % de carbonato de calcio (CaCO3, pulverizado, de pureza analítica) para obtener un pH de 6,0 ± 0,5; la cantidad de carbonato de calcio añadido puede depender principalmente de la calidad o naturaleza de la turba;
—
alrededor del 70 % de arena de cuarzo secada al aire (dependiendo de la cantidad necesaria de CaCO3), en su mayor parte en forma de arena fina, con más del 50 % de las partículas de un tamaño entre 50 y 200 μm.
Es aconsejable demostrar la aptitud de un suelo artificial para el cultivo de los gusanos y el cumplimiento de los criterios de validez del ensayo antes de utilizar el suelo en un ensayo definitivo. En particular, se recomienda hacer un control de ese tipo para garantizar que los resultados del ensayo no se vean comprometidos si el contenido de carbono orgánico del suelo artificial se reduce, por ejemplo rebajando el contenido de turba al 4-5 % y aumentando análogamente el contenido de arena. Con esta reducción del contenido de carbono orgánico, es posible que disminuyan las posibilidades de adsorción de la sustancia problema al suelo (carbono orgánico) y que aumente la disponibilidad de la sustancia problema para los gusanos. Se ha demostrado que Enchytraeus albidus puede ajustarse a los criterios de validez sobre la reproducción cuando se somete a ensayo en suelos de campo con un contenido de carbono orgánico menor que el mencionado más arriba (p. ej., del 2,7 %) (15), y la experiencia (si bien es limitada) demuestra que esto también puede conseguirse en suelo artificial con un 5 % de turba.
Nota: Cuando se utiliza suelo natural en ensayos adicionales (por ejemplo, de nivel superior), deben demostrarse también la idoneidad del suelo y el respeto de los criterios de validez del ensayo.
12.
Los componentes secos del suelo se mezclan a fondo (por ejemplo, en un mezclador de laboratorio de gran escala). Esta operación debe efectuarse al menos una semana antes de que se inicie el ensayo. El suelo mezclado debe mantenerse durante dos días con el fin de equilibrar o estabilizar la acidez. Para la determinación del pH se utiliza una mezcla de suelo y solución de cloruro de potasio 1 M (KCl) o de cloruro de calcio 0,01 M (CaCl2) en una proporción de 1:5 (véase la referencia (16) y el apéndice 3). Si el suelo es más ácido que la banda exigida (véase el punto 11), puede ajustarse añadiendo una cantidad adecuada de CaCO3. Si el suelo es demasiado alcalino, puede ajustarse mediante la adición de más cantidad de la mezcla, mencionada en el punto 11, pero excluyendo el CaCO3.
13.
La capacidad máxima de retención de agua del suelo artificial se determina de acuerdo con los procedimientos descritos en el apéndice 2. Uno o dos días antes del inicio del ensayo, el suelo artificial seco se prehumedece, añadiéndole una cantidad suficiente de agua desionizada para obtener aproximadamente la mitad del contenido final de agua, que supone de un 40 a un 60 % de la capacidad máxima de retención de agua. Al inicio del ensayo, el suelo prehumedecido se divide en las partes correspondientes al número de concentraciones de ensayo (y de sustancias de referencia en su caso) y de controles utilizados en el ensayo. El contenido de humedad se ajusta al 40 - 60 % de la capacidad máxima de retención de agua mediante la adición de la solución de la sustancia problema y/o añadiendo agua desionizada o destilada (véanse los puntos 19 a 21). Se determina el contenido de humedad al inicio y al final del ensayo (por secado hasta la obtención de un peso constante a 105 °C); dicho contenido debe estar en la banda óptima para la supervivencia de las lombrices. Una estimación general del contenido de humedad del suelo puede obtenerse apretando el suelo suavemente con la mano; si el contenido de humedad es correcto, deben aparecer gotitas de agua entre los dedos.
Selección y preparación de los animales de ensayo
14.
La especie recomendada es Enchytraeus albidus Henle 1837 (gusano blanco), miembro de la familia Enchytraeidae (orden Oligochaeta, filum Annelida). E. albidus es una de las mayores especies de enquitreidos, y se han observado especímenes de hasta 35 mm de longitud (17) (18). E. albidus tiene distribución mundial y se encuentra en hábitats marinos, de agua dulce y terrestres, sobre todo en materia orgánica en descomposición (algas, compost) y raramente en praderas (9). Su amplia tolerancia ecológica y algunas variaciones morfológicas podrían indicar que existen diferentes razas.
15.
E. albidus se encuentra en el comercio, como alimento para peces. Ha de comprobarse si el cultivo está contaminado con otras especies, generalmente más pequeñas (1) (19). Si hay contaminación, se deben lavar todos los gusanos con agua en una placa Petri. Se seleccionan a continuación los ejemplares adultos grandes de E. albidus (empleando un microscopio estereoscópico) para iniciar un nuevo cultivo y se desechan todos los demás gusanos. E. albidus pueden criarse en una amplia gama de materiales orgánicos (véase el apéndice 4). El ciclo de vida de E. albidus es corto, ya que se alcanza la madurez entre los 33 días (a 18 °C) y los 74 días (a 12 °C) (1). Se utilizarán para el ensayo solo los cultivos que hayan permanecido sin problemas en el laboratorio al menos cinco semanas (una generación).
16.
17.
Los animales utilizados en los ensayos son gusanos adultos. Deben tener huevos (puntos blancos) en la región del clitelo, y ser aproximadamente del mismo tamaño (de aproximadamente 1 cm de longitud). No es necesario sincronizar el cultivo de cría.
18.
Si los enquitreidos no se crían en el mismo tipo de suelo y en las mismas condiciones (incluida la alimentación) que se utilizan para el ensayo final, deben aclimatarse durante al menos 24 horas y hasta tres días. Conviene, en un primer momento, aclimatar un número de adultos mayor que el necesario para realizar el ensayo, a fin de dejar margen suficiente para el rechazo de especímenes dañados o inadecuados por cualquier otro concepto. Al final de la fase de aclimatación, se seleccionan para el ensayo solo los gusanos que contengan huevos y no presenten anomalías de comportamiento (por ejemplo, que traten de escapar del suelo). Los gusanos se retiran cuidadosamente utilizando pinzas de joyero, ganchos o asas y se colocan en una placa Petri que contenga una pequeña cantidad de agua dulce. Con este objeto es preferible utilizar agua dulce reconstituida según lo propuesto en el capítulo C.20 del presente anexo (ensayo de reproducción en Daphnia magna), ya que el agua desionizada, desmineralizada o del grifo puede ser nociva para los gusanos. Los gusanos se inspeccionan con un microscopio estereoscópico y se eliminan los que no contengan huevos. Se ha de tener cuidado para retirar y desechar los ácaros o colémbolos que puedan haber infectado los cultivos. Los gusanos sanos no utilizados para el ensayo se devuelven al cultivo madre.
Preparación de las concentraciones de ensayo
Sustancia problema hidrosoluble
19.
Se prepara una solución de la sustancia problema en agua desionizada en una cantidad suficiente para todas las réplicas de una sola concentración de ensayo. Se recomienda utilizar una cantidad apropiada de agua para conseguir el contenido necesario de humedad, es decir, entre el 40 y el 60 % de la capacidad máxima de retención de agua (véase el punto 13). Cada una de las soluciones de la sustancia problema se mezcla a fondo con un lote de suelo prehumedecido antes de introducirla en el recipiente de ensayo.
Sustancia problema no hidrosoluble
20.
En el caso de las sustancias no solubles en el agua, pero solubles en disolventes orgánicos, la sustancia problema puede disolverse en el volumen mínimo posible de un vehículo adecuado (por ejemplo, acetona). Solo deben utilizarse disolventes volátiles. El vehículo se rocía sobre una pequeña cantidad, como, por ejemplo, 2,5 g de arena de cuarzo fina, o se mezcla con ella. El vehículo se elimina por evaporación bajo una campana extractora durante al menos una hora. Esta mezcla de arena de cuarzo y sustancia problema se añade al suelo prehumedecido y se mezcla completamente después de añadir la cantidad adecuada de agua desionizada para obtener la humedad necesaria. La mezcla final se introduce en los recipientes de ensayo.
21.
En el caso de sustancias poco solubles en agua y en disolventes orgánicos, se mezcla el equivalente de 2,5 g de arena de cuarzo finamente molida por recipiente de ensayo con la cantidad de sustancia problema necesaria para obtener la concentración de ensayo deseada. Esta mezcla de arena de cuarzo y sustancia problema se añade al suelo prehumedecido y se mezcla completamente después de añadir la cantidad adecuada de agua desionizada para obtener el contenido necesario de humedad. La mezcla final se divide entre los recipientes de ensayo. Se repite el procedimiento para cada concentración de ensayo, y se prepara asimismo un control adecuado.
22.
Normalmente, las sustancias no deben someterse a ensayo a concentraciones superiores a 1 000 mg/kg de masa seca de suelo. Sin embargo, puede ser necesario efectuar ensayos a concentraciones más elevadas, de conformidad con los objetivos de un ensayo específico.
REALIZACIÓN DE LOS ENSAYOS
Grupos de ensayo y controles
23.
Respecto a cada concentración de ensayo, se coloca en el recipiente de ensayo una cantidad de suelo de ensayo correspondiente a 20 g de peso seco, (véanse los puntos 19 - 21). Se preparan también controles, sin la sustancia problema. A cada recipiente se añaden alimentos con arreglo a los procedimientos descritos en el punto 29. Se asignan aleatoriamente diez gusanos a cada recipiente de ensayo. Los gusanos se transfieren con cuidado a cada recipiente de ensayo y se colocan en la superficie del suelo, por ejemplo utilizando pinzas de joyero, ganchos o asas. El número de réplicas para las concentraciones de ensayo y para los controles dependerá del diseño del ensayo (véase el punto 34). Los recipientes de ensayo se colocan en la incubadora de ensayo de forma aleatoria, y estas posiciones se vuelven a aleatorizar cada semana.
24.
Si se utiliza un vehículo para la aplicación de la sustancia problema, debe someterse a ensayo, además de la serie con la sustancia problema, una serie de control con arena de cuarzo rociada o mezclada con el disolvente. La concentración de disolvente o dispersante ha de ser igual a la usada en los recipientes de ensayo que contienen la sustancia problema. Debe realizarse el ensayo de una serie de control con arena de cuarzo adicional (2,5 g por recipiente) en caso de sustancias que requieran añadirse de conformidad con los procedimientos descritos en el punto 21.
Condiciones del ensayo
25.
La temperatura de ensayo es de 20 ± 2 °C. Para disuadir a los gusanos de escaparse del suelo, se efectúa el ensayo en ciclos controlados de luz y oscuridad (preferentemente de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad) con una iluminación de 400 a 800 lux en la zona de los recipientes de ensayo.
26.
Con el fin de controlar la humedad del suelo, los recipientes se pesan al principio del ensayo y, posteriormente, una vez por semana. La pérdida de peso se compensa con la adición de una cantidad adecuada de agua desionizada. Cabe señalar que la pérdida de agua puede reducirse mediante el mantenimiento de una alta humedad ambiental (> 80 %) en la incubadora de ensayo.
27.
El contenido de humedad y el pH han de medirse al principio y al final tanto de la prueba de determinación del intervalo como del ensayo definitivo. Deben efectuarse mediciones en muestras del suelo control y tratado (todas las concentraciones) que se habrán preparado y mantenido en las mismas condiciones que los cultivos de ensayo, pero sin adición de gusanos. Solo deben añadirse alimentos a estas muestras de suelo al comienzo del ensayo para facilitar la actividad microbiana. La cantidad de alimentos que se añade debe ser la misma que se añade a los cultivos de ensayo. No es necesario añadir más alimentos a estos recipientes durante el ensayo.
Alimentación
28.
Pueden utilizarse alimentos capaces de mantener la población de enquitreidos. Se ha visto que los copos de avena, preferiblemente tratados en el autoclave antes de su utilización para evitar la contaminación microbiana (el calentamiento también es adecuado), constituyen un alimento adecuado.
29.
Los alimentos se añaden, al inicio, mezclando 50 mg de copos de avena molidos con el suelo de cada recipiente antes de introducir los gusanos. Después, los alimentos se suministran una vez por semana hasta el día 21. No se añaden alimentos el día 28, puesto que los adultos se han retirado en esta fase y los gusanos juveniles necesitan relativamente poca comida adicional más allá de este punto. Durante el ensayo, la alimentación se compone de 25 mg de copos de avena molidos por recipiente colocados cuidadosamente en la superficie del suelo para evitar dañar a los gusanos. Con el fin de reducir el crecimiento de hongos, los copos de avena deben enterrarse en el suelo cubriéndolos con pequeñas cantidades de este. Si queda comida sin consumir, la ración alimentaria debe reducirse.
Diseño para el ensayo de determinación del intervalo
30.
Cuando sea necesario, se llevará a cabo un ensayo de determinación del intervalo con, por ejemplo, cinco concentraciones de la sustancia problema, de 0,1, 1,0, 10, 100 y 1 000 mg/kg (peso seco de suelo). Es suficiente con una sola réplica para cada tratamiento y control.
31.
La duración del ensayo de determinación del intervalo es de seis semanas. Al final del ensayo se determina la mortalidad de los gusanos. Se considera que un gusano está muerto si no reacciona ante un estímulo mecánico en el extremo anterior. Puede ser útil disponer de otros datos además de la mortalidad a la hora de decidir sobre el intervalo de concentraciones que debe usarse en el ensayo definitivo. Por tanto, también deben registrarse los cambios en el comportamiento de los adultos (por ejemplo, si se vuelven incapaces de excavar en el suelo o si se quedan inmóviles junto a la pared de vidrio del recipiente de ensayo) y en su morfología (p. ej., si tienen heridas abiertas), además de la eventual presencia de juveniles. Esta última puede determinarse con el método de tinción descrito en el apéndice 6.
32.
La LC50 puede determinarse aproximadamente calculando la media geométrica de los datos de mortalidad. Al determinar el intervalo de concentraciones para el ensayo definitivo, se supone que la concentración con efecto sobre la reproducción es hasta diez veces inferior a la LC50. No obstante, se trata de una relación empírica y en algún caso específico podría ser diferente. Las observaciones adicionales realizadas en el ensayo de determinación del intervalo de concentraciones, tales como la presencia de juveniles, pueden contribuir a afinar el intervalo de concentraciones de la sustancia problema que debe utilizarse en el ensayo definitivo.
33.
Con el fin de determinar de forma exacta la LC50, se recomienda realizar el ensayo utilizando un mínimo de cuatro réplicas de cada concentración de la sustancia problema y un número adecuado de concentraciones que causen al menos cuatro respuestas medias con diferencias estadísticamente significativas a estas concentraciones. Para los controles se utiliza un número similar de concentraciones y de réplicas, en su caso.
Diseño para el ensayo definitivo de reproducción
34.
Se proponen tres diseños sobre la base de las recomendaciones derivadas de una prueba interlaboratorios (2).
—
Para la determinación de la NOEC deben someterse a ensayo al menos cinco concentraciones en serie geométrica. Se recomienda utilizar cuatro réplicas de cada concentración de ensayo más ocho controles. Las concentraciones deben estar separadas por un factor que no exceda de 1,8.
—
Para la determinación de una ECx (p. ej., EC10, EC50), deben someterse a ensayo al menos cinco concentraciones, entre las que debe quedar englobada la ECx a fin de obtenerla mediante interpolación y no extrapolación. Se recomienda utilizar al menos cuatro réplicas de cada concentración de ensayo y cuatro réplicas de control. El factor de espaciado puede variar, es decir, ser igual o inferior a 1,8 en el intervalo de efecto previsto y superior a 1,8 a concentraciones superiores e inferiores.
—
Un enfoque combinado permite la determinación tanto de la NOEC como de la ECx. Deben utilizarse ocho concentraciones de tratamiento en progresión geométrica. Se recomienda utilizar cuatro réplicas de cada tratamiento más ocho controles. Las concentraciones deben estar separadas por un factor que no exceda de 1,8.
35.
Se deben utilizar diez gusanos adultos por recipiente de ensayo (véase el punto 23). Se añaden alimentos a los recipientes de ensayo al inicio del ensayo y, a continuación, una vez por semana (véase el punto 29) hasta el día 21, incluido. El día 21 se toman a mano muestras de suelo y se observan y recuentan los gusanos adultos vivos, y se registran los cambios en el comportamiento (por ejemplo, si se vuelven incapaces de excavar en el suelo o si se quedan inmóviles junto a la pared de vidrio del recipiente de ensayo) y en la morfología (p. ej., si tienen heridas abiertas). A continuación, se retiran todos los gusanos adultos de los recipientes de ensayo y del suelo de ensayo. El suelo de ensayo que contiene los capullos que se hayan producido se incuba durante tres semanas adicionales en las mismas condiciones de ensayo, salvo que solo se añaden alimentos el día 35 (es decir, 25 mg de copos de avena molidos por recipiente).
36.
Después de seis semanas, se efectúa el recuento de los gusanos recién nacidos. Se recomienda el método basado en la tinción con rojo de Bengala (véase el apéndice 6), aunque también se ha comprobado que son adecuadas otras técnicas de extracción y flotación por vía húmeda (pero sin calentamiento) (véase el apéndice 6) (4) (10) (11) (20). Se recomienda la tinción con rojo de Bengala porque la extracción por vía húmeda a partir de un sustrato de suelo puede verse obstaculizada por la turbidez causada por partículas de arcilla en suspensión.
Ensayo límite
37.
Si no se observan efectos a la concentración máxima en el ensayo de determinación del intervalo (es decir, 1 000 mg/kg), el ensayo de reproducción puede realizarse como un ensayo límite con 1 000 mg/kg, con el fin de demostrar que la NOEC para la reproducción es superior a ese valor.
Resumen y calendario del ensayo
38.
Las etapas del ensayo pueden resumirse como sigue:
Día
Ensayo de determinación del intervalo
Ensayo definitivo
Día –7 o antes
—
Preparación del suelo artificial (mezcla de los componentes secos)
—
Preparación del suelo artificial (mezcla de los componentes secos)
Día –5
—
Verificación del pH del suelo artificial
—
Medición de la capacidad máxima de retención de agua del suelo
—
Verificación del pH del suelo artificial
—
Medición de la capacidad máxima de retención de agua del suelo
Días –5 a –3
—
Clasificación de las lombrices para su aclimatación
—
Clasificación de las lombrices para su aclimatación
Días –3 a 0
—
Aclimatación de las lombrices durante al menos 24 horas
—
Aclimatación de las lombrices durante al menos 24 horas
Día –1
—
Prehumidificación del suelo artificial y distribución en lotes
—
Prehumidificación del suelo artificial y distribución en lotes
Día 0
—
Preparación de las soluciones madre
—
Aplicación de la sustancia problema
—
Pesada del sustrato problema en los recipientes de ensayo
—
Adición de los alimentos
—
Introducción de las lombrices
—
Medición del pH y del contenido de humedad del suelo
—
Preparación de las soluciones madre
—
Aplicación de la sustancia problema
—
Pesada del sustrato problema en los recipientes de ensayo
—
Adición de los alimentos
—
Introducción de las lombrices
—
Medición del pH y del contenido de humedad del suelo
Día 7
—
Comprobación del contenido de humedad del suelo
—
Comprobación del contenido de humedad del suelo
—
Adición de alimentos
Día 14
—
Determinación de la mortalidad de los adultos
—
Estimación del número de juveniles
—
Medición del pH y del contenido de humedad del suelo
—
Comprobación del contenido de humedad del suelo
—
Adición de alimentos
Día 21
—
Observación del comportamiento de los adultos
—
Retirada de los adultos
—
Determinación de la mortalidad de los adultos
—
Comprobación del contenido de humedad del suelo
—
Adición de alimentos
Día 28
—
Comprobación del contenido de humedad del suelo
—
Sin adición de alimentos
Día 35
—
Comprobación del contenido de humedad del suelo
—
Adición de alimentos
Día 42
—
Recuento de los gusanos juveniles
—
Medición del pH y del contenido de humedad del suelo
DATOS E INFORME
Tratamiento de los resultados
39.
A pesar de que se da una visión de conjunto en el apéndice 7, en este método de ensayo no se incluye ninguna orientación estadística definitiva para el análisis de los resultados del ensayo.
40.
En la prueba de determinación del intervalo, el parámetro principal es la mortalidad. Sin embargo, también deben registrarse los cambios en el comportamiento (por ejemplo, si se vuelven incapaces de excavar en el suelo o si se quedan inmóviles junto a la pared de vidrio del recipiente de ensayo) y en la morfología (p. ej., si tienen heridas abiertas) de los gusanos adultos, además de la eventual presencia de juveniles. Para determinar la LC50 debe aplicarse en principio el análisis de probit (21) o la regresión logística. No obstante, en aquellos casos en que este método de análisis no sea adecuado (por ejemplo, si se dispone de menos de tres concentraciones con mortalidades parciales) pueden utilizarse métodos alternativos. Entre estos métodos pueden figurar el de medias móviles (22), el método de Spearman-Karber recortado (23) o una interpolación simple (p. ej., media geométrica de LC0 y LC100, calculada multiplicando la raíz cuadrada de LC0 por LC100).
41.
En el ensayo definitivo, el parámetro del ensayo es la fecundidad (es decir, el número de juveniles producidos). Sin embargo, como en el ensayo de determinación del intervalo, deben registrarse en el informe final todos los demás signos de naturaleza nociva. El análisis estadístico requiere que se calculen la media aritmética y la desviación típica por grupo de tratamiento y por grupo de control en cuanto a la reproducción.
42.
Si se ha realizado el análisis de la varianza, la desviación típica, s, y los grados de libertad, df, pueden sustituirse respectivamente por la estimación de la varianza “agrupada” obtenida del ANOVA y por sus grados de libertad, siempre que la varianza no dependa de la concentración. En este caso, se utilizarán las distintas varianzas de los controles y de los grupos tratados. Estos valores son calculados en general por programas estadísticos comerciales utilizando los resultados de cada recipiente como réplicas. Si la “agrupación” de datos de los controles negativo y de disolvente parece más razonable que hacer las pruebas respecto a uno solo de estos conjuntos, debe comprobarse que no son significativamente diferentes (sobre pruebas apropiadas, véanse el punto 45 y el apéndice 7).
43.
La realización de más pruebas estadísticas y de deducciones depende de si los valores de las réplicas se distribuyen normalmente y son homogéneas en lo que respecta a su varianza.
Estimación de la NOEC
44.
Es preferible la aplicación de ensayos potentes. Se debería utilizar la información previa obtenida, por ejemplo a partir de la experiencia con ensayos interlaboratorios u otros datos históricos, sobre si los datos presentan una distribución aproximadamente normal. Es más crítica la homogeneidad de la varianza (homoscedasticidad). La experiencia indica que la varianza suele aumentar cuando sube la media. En estos supuestos, una transformación de los datos podría llevar a la homoscedasticidad. Sin embargo, esta transformación debe basarse en la experiencia con datos históricos, más que en los datos objeto de la investigación. Con datos homogéneos, deben llevarse a cabo pruebas t de comparación múltiple, como la prueba de Williams (α = 0,05, unilateral) (24) (25) o, en algunos casos, la prueba de Dunnett (26) (27). Cabe señalar que, en caso de replicación desigual, los valores t del cuadro deberán corregirse según lo sugerido por Dunnett y Williams. En ocasiones, debido a una gran variación, las respuestas no aumentan o disminuyen regularmente. En este caso de fuerte desviación respecto a la monotonicidad, es más conveniente la prueba de Dunnett. En caso de que haya desviaciones con respecto a la homoscedasticidad, puede resultar razonable analizar más estrechamente los posibles efectos sobre las varianzas, a fin de decidir si las pruebas t pueden aplicarse sin perder mucha potencia (28). De forma alternativa, puede aplicarse una prueba U de comparación múltiple, por ejemplo la prueba U de Bonferroni según Holm (29), o, cuando estos datos presenten heteroscedasticidad pero por lo demás sean coherentes con una relación dosis-respuesta monótona subyacente, otra prueba no paramétrica [por ejemplo, una prueba de Jonckheere-Terpstra (30) (31) o Shirley (32) (33)] y, en general, se dará preferencia a estas pruebas frente a las pruebas t de varianza desigual (véase también el esquema del apéndice 7).
45.
En caso de que se haya realizado un ensayo límite y se cumplan los requisitos previos de procedimientos de ensayos paramétricos (normalidad, homogeneidad), puede utilizarse la prueba t de Student pareada o, si no, el procedimiento de la prueba U de Mann-Whitney (29).
Estimación de ECx
46.
Para calcular cualquier valor de ECx se utilizan las medias por tratamiento para el análisis de regresión (lineal o no lineal), tras haber obtenido una función dosis-respuesta adecuada. En relación con el crecimiento de los gusanos como respuesta continua, pueden calcularse los valores de ECx utilizando el análisis de regresión adecuado (35). Entre las funciones adecuadas para los datos cuánticos (mortalidad/supervivencia y número de descendientes producidos) están las funciones sigmoideas normales, logísticas o de Weibull, con entre dos y cuatro parámetros, algunas de las cuales pueden modelizar también respuestas horméticas. Si la función dosis-respuesta se ha ajustado mediante análisis de regresión lineal, debe determinarse con el análisis de regresión un r2 (coeficiente de determinación) y/o una pendiente significativos antes de estimar la ECx mediante la inserción de un valor correspondiente a x % de la media del control en la ecuación encontrada con el análisis de regresión. Se calculan límites de confianza del 95 % con arreglo al método de Fieller [citado en Finney (21)] u otros métodos adecuados modernos.
47.
Otra posibilidad consiste en modelizar la respuesta como porcentaje o proporción del parámetro del modelo que se interpreta como la respuesta media del control. En estos casos, la curva sigmoidea normal (logística, Weibull) puede ajustarse a menudo fácilmente a los resultados utilizando el método de regresión de probit (21). En estos casos, la función de ponderación ha de ajustarse para respuestas métricas según indica Christensen (36). No obstante, si se ha observado hormesis, el análisis de probit debe ser sustituido por una función logística o de Weibull de cuatro parámetros, ajustada por un método de regresión no lineal (36). Si no puede ajustarse a los datos una función dosis-respuesta adecuada, podrán utilizarse métodos alternativos para calcular el valor de ECx y sus límites de confianza, tales como el método de medias móviles de Thompson (22) y el de Spearman-Karber recortado (23).
INFORME DEL ENSAYO
48.
El informe del ensayo deberá incluir la información siguiente:
Sustancia problema:
—
naturaleza física y propiedades fisicoquímicas pertinentes (p, ej., hidrosolubilidad, presión de vapor, etc.),
—
identificación química de la sustancia problema según la nomenclatura de la IUPAC, número CAS, lote de fabricación, lote de acondicionamiento, fórmula estructural y pureza,
—
fecha de expiración de la muestra.
Especies de ensayo:
—
animales utilizados en el ensayo: especie, nombre científico, origen de los organismos y condiciones de cría.
Condiciones de ensayo:
—
ingredientes y preparación del suelo artificial,
—
método de aplicación de la sustancia problema,
—
descripción de las condiciones de ensayo, como la temperatura, la humedad, el pH, etc.,
—
descripción completa del diseño experimental y procedimientos.
Resultados del ensayo:
—
mortalidad de los gusanos adultos tras dos semanas y número de juveniles al final del ensayo de determinación del intervalo,
—
mortalidad de los gusanos adultos tras una exposición de tres semanas y registro completo de los juveniles al final del ensayo de determinación del intervalo,
—
cualquier síntoma físico o patológico y cambio en el comportamiento de los organismos de ensayo que se haya observado,
—
la LC50, la NOEC y/o ECx (p. ej., EC50, EC10) para la reproducción si algunas de ellas son aplicables con intervalos de confianza, y un gráfico del modelo ajustado utilizado para su cálculo, todas las informaciones y observaciones útiles para la interpretación de los resultados.
Las eventuales desviaciones respecto a los procedimientos descritos en el presente método de ensayo y cualquier acontecimiento inusual ocurrido en el ensayo.
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(5)
Capítulo C.8 del presente anexo. Toxicidad para gusanos de tierra.
(6)
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(7)
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Apéndice 1
Definiciones
A efectos del presente método de ensayo, se aplicarán las siguientes definiciones:
Sustancia : sustancia o mezcla.
ECx (concentración con efecto al x %): concentración que provoca el x % de un efecto sobre los organismos de ensayo dentro de un determinado período de exposición cuando se compara con un control. En este ensayo las concentraciones con efecto se expresan en masa de sustancia problema por masa seca del suelo de ensayo.
LC0 (concentración no letal): concentración de una sustancia problema que no mata a ninguno de los organismos de ensayo expuestos dentro de un determinado período de tiempo. En este ensayo la LC0 se expresa en masa de sustancia problema por masa seca del suelo de ensayo.
LC50 (concentración letal mediana): concentración de una sustancia problema que mata al 50 % de los organismos de ensayo expuestos dentro de un determinado período de tiempo. En este ensayo la LC50 se expresa en masa de sustancia problema por masa seca del suelo de ensayo.
LC100 (concentración totalmente letal): concentración de una sustancia problema que mata al 100 % de los organismos de ensayo expuestos dentro de un determinado período de tiempo. En este ensayo la LC100 se expresa en masa de sustancia problema por masa seca del suelo de ensayo.
LOEC (concentración mínima con efecto observado): concentración mínima de la sustancia problema que tiene un efecto estadísticamente significativo (p < 0,05). En este ensayo la LOEC se expresa en masa de sustancia problema por masa seca del suelo de ensayo. Todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC deben presentar normalmente un efecto que es estadísticamente diferente del del control. Cualquier desviación respecto de lo anterior en la determinación de la LOEC debe justificarse en el informe de ensayo.
NOEC (concentración sin efecto observado): concentración más elevada de la sustancia problema inmediatamente por debajo de la LOEC a la que no se observa ningún efecto. En este ensayo, la concentración correspondiente a la NOEC no ejerce ningún efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro de un determinado período de exposición en comparación con el control.
Tasa de reproducción : número medio de gusanos juveniles producidos por un número de gusanos adultos durante el período de ensayo.
Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.
Apéndice 2
Determinación de la capacidad máxima de retención de agua
Determinación de la capacidad de retención de agua del suelo artificial
El siguiente método se ha considerado apropiado. Se describe en el anexo C de la norma ISO DIS 11268-2.
Se recoge una determinada cantidad (p. ej., 5 g) del sustrato de suelo de ensayo, utilizando un dispositivo adecuado (tubo de barrena, etc.). Se cubre el fondo del tubo con un trozo de papel de filtro y, después de llenarlo con agua, se coloca en un soporte en un baño de agua. El tubo debe sumergirse gradualmente hasta que el nivel del agua esté por encima del extremo superior del suelo. A continuación, se debe dejar en el agua alrededor de tres horas. Dado que no puede retenerse toda el agua absorbida por los capilares del suelo, la muestra de suelo debe dejarse escurrir durante un período de dos horas, colocando el tubo en un lecho de arena de cuarzo finamente molida muy húmeda y contenida en un recipiente cerrado (para evitar que se seque). Después, la muestra debe pesarse y secarse hasta obtener una masa constante a 105 °C. La capacidad de retención de agua (WHC) puede calcularse entonces de la manera siguiente:
Formula
donde:
S
=
masa del sustrato saturado de agua + masa del tubo + masa del papel de filtro
T
=
tara (masa del tubo + masa del papel de filtro)
D
=
masa seca del sustrato
BIBLIOGRAFÍA:
ISO (Organización Internacional de Normalización) (1996). Calidad del suelo: Efectos de los contaminantes sobre las lombrices de tierra (Eisenia fetida). Parte 2: Determinación de los efectos en la reproducción, no 11268-2. ISO, Ginebra.
Apéndice 3
Determinación del pH del suelo
El siguiente método de determinación del pH de una muestra de suelo se basa en la descripción recogida en la norma ISO 10390 (Calidad del suelo. Determinación del pH).
Una determinada cantidad de suelo se seca a temperatura ambiente durante al menos 12 horas. A continuación se hace una suspensión del suelo (con al menos 5 gramos de este) en cinco veces su volumen de una solución 1 M de cloruro de potasio de grado analítico (KCl) o de una solución 0,01 M de cloruro de calcio de grado analítico (CaCl2). La suspensión se agita enérgicamente durante cinco minutos. Después de agitarla, se deja reposar la suspensión desde 2 horas como mínimo hasta 24 horas como máximo. El pH de la fase líquida se mide a continuación utilizando un pH-metro, que habrá sido calibrado antes de cada medición con una serie adecuada de soluciones amortiguadoras (p. ej., a un pH de 4,0 y 7,0).
BIBLIOGRAFÍA:
ISO (Organización Internacional de Normalización) (1994). Calidad del suelo, Determinación del pH, no 10390. ISO, Ginebra.
Apéndice 4
Condiciones de cultivo de Enchytraeus sp.
Los enquitreidos de la especie Enchytraeus albidus (así como otras especies de Enchytraeus) pueden cultivarse en grandes cajas de plástico (p. ej., de 30 × 60 × 10 cm) rellenas de una mezcla 1:1 de suelo artificial y de suelo de jardín natural sin contaminar. Debe evitarse el material compostado, ya que podría contener sustancias tóxicas, como metales pesados. Hay que eliminar la fauna del suelo antes de su utilización (p. ej., mediante congelación). También puede utilizarse un sustrato que incluya solamente suelo artificial, pero la tasa de reproducción podría ser menor que la obtenida con un sustrato de suelo mixto. El sustrato utilizado para el cultivo debe tener un pH de 6,0 ± 0,5.
El cultivo se mantiene en la oscuridad a una temperatura de 15 a 20 °C ± 2 °C. Deben evitarse las temperaturas superiores a 23 °C. El suelo debe estar húmedo, pero no empapado. El contenido de humedad del suelo es correcto si aparecen gotitas de agua entre los dedos al apretar un puñado de suelo suavemente con la mano. Hay que evitar la aparición de condiciones anóxicas velando por que las tapas de los recipientes de cultivo permitan un adecuado intercambio de gases con la atmósfera. Hay que remover el suelo cuidadosamente cada semana, para facilitar la aireación.
Los gusanos pueden alimentarse de copos de avena. La avena debe conservarse en recipientes herméticamente cerrados y tratados en el autoclave o calentados antes de su utilización, para evitar su infestación por ácaros de la harina (p. ej., Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) o ácaros depredadores [p. ej., Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina]. Después del tratamiento térmico, el producto debe molerse de forma que sea fácil de espolvorear sobre la superficie del suelo. De vez en cuando, los copos de avena pueden completarse mediante la adición de vitaminas, leche y aceite de hígado de bacalao. Otras posibles fuentes de alimento son la levadura de panadería o la comida para peces “Tetramin”.
El alimento se aporta aproximadamente dos veces por semana. Se reparte una cantidad apropiada de copos de avena por la superficie del suelo o se introduce cuidadosamente en el sustrato cuando se remueve el suelo para facilitar su aireación. La cantidad absoluta de alimentos aportados depende del número de gusanos presente en el soporte. A título indicativo, la cantidad de alimentos debe incrementarse si se consume íntegramente en el plazo de un día desde que se aporta. Por el contrario, debe reducirse si sigue habiendo alimentos en la superficie en el momento de la segunda aportación (una semana más tarde). Los alimentos contaminados con crecimiento de hongos deben retirarse y sustituirse. Al cabo de tres meses, los gusanos se deben transferir a un sustrato recién preparado.
Se considera que las condiciones de cultivo son satisfactorias si los gusanos: a) no intentan salir del sustrato de suelo, b) se mueven rápidamente por el suelo, c) muestran una superficie externa brillante sin partículas de suelo adheridas, d) son de color más o menos blanquecino, e) presentan diversas bandas de edad en los cultivos, y f) se reproducen continuamente.
Apéndice 5
Realización del ensayo con otras especies de Enchytraeus
Selección de las especies
Pueden utilizarse especies distintas de E. albidus, pero el procedimiento de ensayo y los criterios de validez deberán adaptarse en consecuencia. Como muchas especies de Enchytraeus pueden conseguirse con facilidad y mantenerse satisfactoriamente en el laboratorio, el criterio más importante para seleccionar una especie distinta de E. albidus es la pertinencia ecológica y, de forma adicional, la sensibilidad comparable. También puede haber razones oficiales para un cambio de especies. Por ejemplo, en los países en que no esté presente E. albidus y no pueda importarse (debido, por ejemplo, a restricciones cuarentenarias), será necesario recurrir a otra especie de Enchytraeus.
Ejemplos de especies alternativas adecuadas
— —
Enchytraeus buchholzi (Vejdovsky 1879): Esta denominación cubre probablemente un grupo de especies estrechamente emparentadas que son difíciles de distinguir morfológicamente. No se recomienda su uso en el ensayo mientras no puedan identificarse los individuos utilizados en un ensayo a nivel de especie. E. buchholzi se encuentra generalmente en praderas y lugares alterados, como las cunetas.
—
Enchytraeus luxuriosus: Esta especie fue conocida inicialmente como E. “minutus”, pero se ha descrito recientemente (1). Fue descubierta en primer lugar por U. Graefe (Hamburgo) en una pradera próxima a St. Peter-Ording (Schleswig-Holstein, Alemania). E. luxuriosus tiene un tamaño aproximadamente la mitad del de E. albidus pero es mayor que las demás especies que se comentan en este documento; por ello puede constituir una buena alternativa a E. albidus.
—
Condiciones de cría
Todas las especies de Enchytraeus arriba mencionadas pueden cultivarse en los mismos sustratos que se utilizan para E. albidus. Su menor tamaño hace que los recipientes de cultivo puedan ser más pequeños y que, si bien pueden utilizarse los mismos alimentos, el tamaño de la ración deba adaptarse. El ciclo de vida de esta especie es más corto que el de E. albidus y el aporte de alimentos debe llevarse a cabo con mayor frecuencia.
Condiciones del ensayo
Las condiciones del ensayo son generalmente las mismas que en el caso de E. albidus, salvo que:
—
el recipiente de ensayo puede ser más pequeño (aunque no es necesario);
—
la duración del ensayo de reproducción puede ser más reducida (aunque no es necesario), es decir, puede ser de cuatro en vez de seis semanas; sin embargo, la duración del ensayo de determinación del intervalo no debe modificarse;
—
teniendo en cuenta el pequeño tamaño de los gusanos juveniles, se recomienda encarecidamente el uso del método de tinción para el recuento;
—
el criterio de validez relativo al “número de juveniles por recipiente de ensayo en el control” se ha cambiado a “50”.
BIBLIOGRAFÍA
(1)
Schmelz, R.M. and Collado, R. (1999). Enchytraeus luxuriosus sp.nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeidae, Clitellata, Annelida). Chem 57, 93-100.
Apéndice 6
Descripción detallada de las técnicas de extracción
Tinción con rojo de Bengala
Este método, desarrollado originalmente en ecología lacustre (1), fue propuesto por primera vez para el recuento de juveniles de enquitreidos en el ensayo de reproducción de Enchytraeidae de W. de Coen (Universidad de Gante, Bélgica). Independientemente, el RIVM de Bilthoven desarrolló una versión modificada (rojo de Bengala mezclado con formaldehído en lugar de etanol) (2) (3).
Al final del ensayo definitivo (es decir, al cabo de seis semanas), el suelo de los recipientes de ensayo se transfiere a un recipiente poco profundo. Un recipiente Bellaplast o una cubeta de revelado fotográfico con el fondo acanalado es de utilidad para este propósito, en el segundo caso porque los “canales” restringen el movimiento de los gusanos dentro del campo de observación. Los juveniles se fijan con etanol (unos 5 ml por réplica). Los recipientes se llenan a continuación con agua hasta formar una capa de 1 a 2 cm. Se añaden unas gotas (de 200 a 300 μl) de solución de rojo de Bengala (solución al 1 % en etanol) (en su lugar puede utilizarse eosina al 0,5 %) y se mezclan cuidadosamente los dos componentes. Después de 12 horas, los gusanos deben estar teñidos de color rojizo y ser fáciles de contar porque estarán en la superficie del sustrato. Otra posibilidad es lavar la mezcla de sustrato/alcohol a través de un tamiz (luz de malla: 0,250 mm) antes de proceder al recuento de los gusanos. Mediante este procedimiento, la caolinita, la turba y parte de la arena se eliminarán con el lavado y será más fácil ver y contar los gusanos de color rojizo. El uso de lentes iluminadas (tamaño de la lente de 100 x 75 mm como mínimo, con un factor de ampliación de 2 a 3x) también facilita el recuento.
La técnica de tinción reduce el tiempo del recuento a unos pocos minutos por recipiente y, como orientación, debe ser posible que una persona evalúe todos los recipientes procedentes de un ensayo en un máximo de dos días.
Extracción por vía húmeda
La extracción por vía húmeda debe iniciarse inmediatamente una vez finalizado el ensayo. El suelo de cada recipiente de ensayo se coloca en un tamiz de plástico con una luz de malla de 1 mm aproximadamente. A continuación, los tamices se suspenden en cubetas de plástico, sin tocar el fondo. Las cubetas se llenan cuidadosamente con agua hasta que las muestras de los tamices queden completamente por debajo de la superficie del agua. A fin de garantizar una tasa de recuperación superior al 90 % de los gusanos presentes, debe utilizarse un período de extracción de 3 días a 20 ± 2 °C. Al final del período de extracción se retiran los tamices y el agua (a excepción de un pequeño volumen) se decanta lentamente, teniendo cuidado de no alterar el sedimento que se encuentra en el fondo de las cubetas. A continuación, se agitan ligeramente las cubetas de plástico para suspender el sedimento en el agua sobrenadante. El agua se transfiere a una placa de Petri y, después de que hayan sedimentado las partículas del suelo, los enquitreidos pueden identificarse, retirarse y contarse utilizando un microscopio estereoscópico y pinzas flexibles de acero.
Flotación
En una nota presentada por R. Kuperman se describe un método basado en la flotación (4). Tras fijar con etanol el contenido de un recipiente de ensayo, se cubre el suelo con Ludox (sílice coloidal AM-30, suspensión en agua al 30 % en peso) hasta formar una capa de 10 a 15 mm por encima de la superficie del suelo. Después de mezclar bien el suelo con el agente de flotación durante 2-3 minutos, pueden contarse fácilmente los gusanos juveniles que flotan en la superficie.
Bibliografía
(1)
Korinkova, J. and Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305.
(2)
Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp.
(3)
Posthuma, L., Baerselmann, R., Van Veen, R.P.M. and Dirven-Van Breemen, E.M. (1997). Single and joint toxic effects of copper and zinc on reproduction of Enchytraeus crypticus in relation to sorption of metals in soils. Ecotox. Envir. Safety 38, 108-121.
(4)
Phillips, C.T., Checkai, R.T. and Kuperman, R.G. (1998). An alternative to the O'Connor Method for Extracting Enchytraeids from Soil. SETAC 19th Annual Meeting, Charlotte, EE.UU. Abstract Book No. PMP069, p. 157.
Apéndice 7
Resumen de la evaluación estadística de los datos (determinación de la NOEC) Image
C.33. ENSAYO DE REPRODUCCIÓN DE LOMBRICES DE TIERRA (EISENIA FETIDA / EISENIA ANDREI)
INTRODUCCIÓN
1.
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 222 (2004). Está diseñado para utilizarse en la evaluación de los efectos de las sustancias del suelo sobre el resultado reproductor (y otros parámetros subletales) de las especies de lombrices de tierra Eisenia fetida (Savigny 1826) o Eisenia andrei (Andre 1963) (1) (2). El ensayo ha sido objeto de un ensayo interlaboratorios (3). Ya existe un método de ensayo para el ensayo de toxicidad aguda con lombrices de tierra (4). Se ha publicado una serie de otras directrices internacionales y nacionales de ensayos de toxicidad aguda y crónica con lombrices de tierra (5) (6) (7) (8).
2.
Se considera que Eisenia fetida y Eisenia andrei son representantes de la fauna del suelo y de las lombrices de tierra en particular. Se dispone de datos previos sobre la ecología de las lombrices de tierra y su utilización en ensayos ecotoxicológicos (7) (9) (10) (11) (12).
PRINCIPIO DEL ENSAYO
3.
Las lombrices adultas se exponen a un intervalo de concentraciones de la sustancia problema en el suelo bien mezclada con el suelo o bien, en el caso de los plaguicidas, aplicada al interior o a la superficie de suelo mediante procedimientos coherentes con las pautas de utilización de la sustancia. El método de aplicación es específico al propósito del ensayo. El intervalo de concentraciones de ensayo se selecciona para enmarcar aquellas que pueden causar efectos tanto subletales como letales a lo largo de un período de ocho semanas. Los efectos sobre la mortalidad y sobre el crecimiento de las lombrices adultas se determinan después de cuatro semanas de exposición. A continuación, se retiran los adultos del suelo y se evalúan los efectos sobre la reproducción tras un nuevo período de cuatro semanas mediante el recuento del número de descendientes presentes en el suelo. El resultado reproductor de las lombrices expuestas a la sustancia problema se compara con el del control o controles a fin de determinar i) la concentración sin efecto observado (NOEC) y/o ii) una ECx (p. ej., EC10, EC50) aplicando un modelo de regresión para estimar la concentración que causaría una reducción del x % del resultado reproductor. Las concentraciones de ensayo deben englobar la ECx (p. ej., EC10, EC50) de forma que el valor de ECx se obtenga por interpolación y no por extrapolación (véanse las definiciones del apéndice 1).
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA
4.
Debe disponerse de la siguiente información relativa a la sustancia problema para facilitar el diseño de los procedimientos adecuados de ensayo:
—
hidrosolubilidad,
—
log Pow,
—
presión de vapor,
—
y, cuando sea posible, información sobre el destino y el comportamiento en el medio ambiente (p. ej., velocidad de fotólisis y velocidad de hidrólisis en caso pertinente según las pautas de aplicación).
5.
El presente método de ensayo es aplicable a todas las sustancias con independencia de su hidrosolubilidad. El método de ensayo no es aplicable a las sustancias volátiles, definidas aquí como sustancias cuya constante de Henry o cuyo coeficiente de reparto aire/agua sea superior a uno, ni a las sustancias cuya presión de vapor a 25 °C supere los 0,0133 Pa.
6.
En este método de ensayo no se tiene en cuenta la posible degradación de la sustancia problema a lo largo del período de prueba. Por consiguiente, no puede suponerse que las concentraciones de exposición se van a mantener en sus valores iniciales a lo largo de todo el ensayo. En tal caso, se recomienda realizar el análisis químico de la sustancia problema al inicio y al final del ensayo.
SUSTANCIA DE REFERENCIA
7.
Deben determinarse la NOEC y/o ECx de una sustancia de referencia para ofrecer garantías de que las condiciones de ensayo del laboratorio son adecuadas y para verificar que la respuesta de los organismos de ensayo no cambia estadísticamente a lo largo del tiempo. Se recomienda efectuar un ensayo con una sustancia de referencia al menos una vez al año o, si la frecuencia de los ensayos es menor, en paralelo con la determinación de la toxicidad de una sustancia problema. La carbendazima y el benomilo son sustancias de referencia adecuadas de las que se ha visto que afectan a la reproducción (3). Deben observarse efectos significativos a concentraciones de entre a) 1 y 5 mg de principio activo (p.a.)/kg de peso seco o b) 250 y 500 g/ha o 25 y 50 mg/m2. Si se incluye un patrón tóxico positivo en la serie de ensayo, se utiliza una sola concentración y el número de réplicas debe ser el mismo que el de los controles.
VALIDEZ DEL ENSAYO
8.
Para que el resultado de un ensayo se considere válido, deben cumplirse los siguientes criterios en lo tocante a los controles:
—
cada réplica (con 10 adultos) debe producir ≥ 30 juveniles al final del ensayo;
—
el coeficiente de variación de la reproducción debe ser ≤ 30 %;
—
la mortalidad de los adultos durante las primeras cuatro semanas de la prueba debe ser ≤ 10 %.
Cuando un ensayo no cumpla los criterios de validez arriba indicados, el ensayo debe interrumpirse, salvo que pueda aportarse una justificación para continuar con él. La justificación deberá incluirse en el informe.
DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO
Equipo
9.
Deben utilizarse recipientes de ensayo hechos de vidrio o de otro material químicamente inerte, de una capacidad aproximada de uno a dos litros. Los recipientes deben tener una sección de 200 cm2 aproximadamente de superficie, de forma que se consiga una profundidad de sustrato húmedo de unos 5-6 cm al añadir de 500 a 600 g de masa seca de sustrato. El diseño de la tapa del recipiente debe permitir el intercambio de gases entre el sustrato y la atmósfera, y el acceso a la luz (p. ej., mediante una cubierta transparente perforada), y, al mismo tiempo, evitar que se escapen las lombrices. Si la cantidad de sustrato de ensayo utilizado es notablemente superior a 500 o 600 g por recipiente de ensayo, el número de lombrices debe aumentarse proporcionalmente.
10.
Se precisa el equipo normal de laboratorio y, en particular, el siguiente:
—
estufa secadora;
—
microscopio estereoscópico;
—
pH-metro y fotómetro;
—
balanzas de precisión adecuada;
—
equipo adecuado para el control de la temperatura;
—
equipo adecuado para el control de la humedad (no esencial si los recipientes de exposición tienen tapa);
—
incubadora o pequeña sala con aire acondicionado;
—
pinzas, ganchos o asas;
—
baño de agua.
Preparación del suelo artificial
11.
En este ensayo se utiliza un suelo artificial (5) (7) con la siguiente composición (en peso seco, secado hasta peso constante a 105 °C):
—
10 % de turba esfágnea (con un pH lo más cercano posible a 5,5-6,0, sin restos vegetales visibles, finamente molida, secada hasta conseguir un contenido de humedad determinado y medido);
—
20 % de caolín (contenido de caolinita preferentemente superior al 30 por ciento);
—
entre 0,3 y 1,0 % de carbonato de calcio (CaCO3, pulverizado, de pureza analítica) para obtener un pH inicial de 6,0 ± 0,5;
—
70 % de arena de cuarzo secada al aire (dependiendo de la cantidad necesaria de CaCO3), en su mayor parte en forma de arena fina, con más del 50 % de las partículas de un tamaño entre 50 y 200 μm.
Nota 1: La cantidad necesaria de CaCO3 dependerá de los componentes del sustrato del suelo, incluidos los alimentos, y debe determinarse por mediciones de submuestras del suelo inmediatamente antes del ensayo. El pH se mide en una muestra mezclada con una solución 1 M de cloruro de potasio (KCl) o una solución 0,01 M de cloruro de calcio (CaCl2) (13).
Nota 2: El contenido de carbono orgánico del suelo artificial puede reducirse, por ejemplo rebajando el contenido de turba al 4-5 % y aumentando análogamente el contenido de arena. Con esta reducción del contenido de carbono orgánico, es posible que disminuyan las posibilidades de adsorción de la sustancia problema al suelo (carbono orgánico) y que aumente la disponibilidad de la sustancia problema para las lombrices. Se ha demostrado que Eisenia fetida puede ajustarse a los criterios de validez sobre la reproducción cuando se somete a ensayo en suelos de campo con un contenido menor de carbono orgánico (p. ej., del 2,7 %) (14), y la experiencia demuestra que esto también puede conseguirse en suelo artificial con un 5 % de turba. Por lo tanto, antes de utilizar un suelo de este tipo en un ensayo definitivo no es necesario demostrar que el suelo artificial permite que el ensayo cumpla los criterios de validez, a menos que el contenido de turba se reduzca más de lo especificado anteriormente.
Nota 3: Cuando se utiliza suelo natural en ensayos adicionales (por ejemplo, de nivel superior), deben demostrarse también la idoneidad del suelo y el respeto de los criterios de validez del ensayo.
12.
Los componentes secos del suelo se mezclan a fondo (por ejemplo, en un mezclador de laboratorio de gran escala), en un lugar bien ventilado. Antes del inicio del ensayo, el suelo artificial seco se humedece, añadiéndole una cantidad suficiente de agua desionizada para obtener aproximadamente la mitad del contenido final de agua, que supone de un 40 a un 60 % de la capacidad máxima de retención de agua (correspondiente al 50 ± 10 % de humedad en masa seca). Esto producirá un sustrato que no presenta agua suelta o libre cuando se comprime en la mano. La capacidad máxima de retención de agua del suelo artificial se determina de acuerdo con los procedimientos descritos en el apéndice 2, la norma ISO 11274 (15) u otra norma equivalente de la UE.
13.
Si la sustancia problema se aplica en la superficie del suelo o se introduce en este sin agua, la cantidad final de agua puede introducirse en el suelo artificial durante la preparación del suelo. Si la sustancia problema se introduce en el suelo junto con algo de agua, el agua adicional puede añadirse junto con la sustancia problema (véase el punto 19).
14.
Se determina el contenido de humedad del suelo al inicio y al final del ensayo de conformidad con la norma ISO 11465 (16) u otra norma equivalente de la UE, y el pH del suelo de conformidad con el apéndice 3, la norma ISO 10390 (13) u otra norma equivalente de la UE. Estas determinaciones deben llevarse a cabo en una muestra del suelo control y en una muestra del suelo de cada concentración de ensayo. El pH del suelo no debe ajustarse cuando se ensayen sustancias ácidas o básicas. El contenido de humedad debe comprobarse a lo largo de todo el ensayo pesando los recipientes de manera periódica (véanse los puntos 26 y 30).
Selección y preparación de los animales de ensayo
15.
La especie usada en el ensayo es Eisenia fetida o Eisenia andrei (1) (2). Para iniciar el ensayo es necesario disponer de lombrices adultas de entre dos meses y un año de edad y con clitelo. Las lombrices deben seleccionarse de un cultivo sincronizado con una estructura de edades relativamente homogénea (apéndice 4). Los individuos de un grupo de ensayo no deben diferir por su edad en más de cuatro semanas.
16.
Las lombrices seleccionadas deben aclimatarse durante al menos un día al tipo de sustrato del suelo artificial que vaya a utilizarse en el ensayo. Durante este período deben darse a las lombrices los mismos alimentos que se vayan a utilizar en el ensayo (véanse los puntos 31 a 33).
17.
Al inicio del ensayo deben pesarse individualmente las lombrices, y asignarse aleatoriamente en grupos de diez a los recipientes de ensayo. Las lombrices se lavan (con agua desionizada) antes de su pesada y se elimina el exceso de agua poniendo brevemente las lombrices sobre papel de filtro. El peso húmedo de cada lombriz debe situarse entre 250 y 600 mg.
Preparación de las concentraciones de ensayo
18.
Pueden seguirse dos métodos de aplicación de la sustancia problema: introducción de la sustancia problema en el suelo (véanse los puntos 19 a 21) o aplicación en la superficie del suelo (véanse los puntos 22 a 24). La selección del método adecuado depende de la finalidad del ensayo. En general, se recomienda la introducción de la sustancia problema en el suelo. No obstante, puede ser necesario recurrir a procedimientos de aplicación que sean coherentes con la práctica agrícola normal (por ejemplo, pulverización de formulaciones líquidas o uso de formulaciones especiales de plaguicidas, tales como gránulos o preparaciones para semillas). Los disolventes utilizados para facilitar el tratamiento del suelo con la sustancia problema deben seleccionarse sobre la base de su baja toxicidad para las lombrices de tierra y debe incluirse en el diseño del ensayo un control adecuado de los disolventes (véase el punto 27).
Introducción de la sustancia problema en el suelo
Sustancia problema hidrosoluble
19.
Inmediatamente antes del inicio del ensayo, se prepara una solución de la sustancia problema en agua desionizada, en cantidad suficiente para todas las réplicas de una misma concentración. Puede ser necesario recurrir a un cosolvente para facilitar la preparación de la solución de ensayo. Es conveniente preparar la cantidad de solución necesaria para alcanzar el contenido final de humedad (del 40 al 60 % de la capacidad máxima de retención de agua). La solución se mezcla a fondo con el sustrato del suelo antes de introducirla en un recipiente de ensayo.
Sustancia problema no hidrosoluble
20.
La sustancia problema se disuelve en una pequeña cantidad de un disolvente orgánico apropiado (p. ej., acetona) y, a continuación, se rocía sobre una pequeña cantidad de arena de cuarzo fina o se mezcla con esta. El disolvente se elimina por evaporación bajo una campana extractora durante al menos unos minutos. La arena tratada se mezcla entonces bien con el suelo artificial prehumedecido. A continuación se añade el volumen necesario de agua desionizada para alcanzar un contenido final de humedad del 40 al 60 % de la capacidad máxima de retención de agua, y se mezcla bien. El suelo queda así listo para ponerse en los recipientes de ensayo. Debe tenerse cuidado con la posibilidad de que algunos disolventes sean tóxicos para las lombrices de tierra.
Sustancia problema insoluble en agua y en disolventes orgánicos
21.
Se prepara una mezcla de 10 g de arena de cuarzo industrial finamente molida con la cantidad de sustancia problema necesaria para obtener la concentración de ensayo en el suelo. Esta mezcla se mezcla bien a su vez con el suelo artificial prehumedecido. A continuación se añade el volumen necesario de agua desionizada para alcanzar un contenido final de humedad del 40 al 60 % de la capacidad máxima de retención de agua, y se mezcla bien. El suelo queda así listo para ponerse en los recipientes de ensayo.
Aplicación de la sustancia problema en la superficie del suelo
22.
El suelo se trata después de haberse añadido las lombrices. Los recipientes de ensayo se llenan primero con el sustrato de suelo humedecido y las lombrices pesadas se colocan en la superficie. Las lombrices sanas se entierran normalmente de forma inmediata en el interior del sustrato y, por consiguiente, las lombrices que queden en la superficie al cabo de 15 minutos se definen como dañadas y deben sustituirse. Si se sustituyen lombrices, deben pesarse las nuevas y las sustituidas, de forma que se conozca el peso vivo total del grupo de lombrices de exposición y el peso total del recipiente con las lombrices al comienzo.
23.
Se aplica la sustancia problema. No debe añadirse al suelo antes de que haya pasado media hora desde la introducción de las lombrices (o si sigue habiendo lombrices en la superficie del suelo), a fin de evitar la exposición directa a la sustancia problema por contacto con la piel. Si la sustancia problema es un plaguicida, puede ser conveniente aplicarla a la superficie del suelo por rociado. La sustancia problema debe aplicarse a la superficie del suelo de la manera más uniforme posible, utilizando un dispositivo de rociado de laboratorio adecuado para simular la aplicación por rociado en el campo. Antes de la aplicación, debe retirarse la tapa del recipiente de ensayo y sustituirse por un forro que proteja las paredes del recipiente frente al aerosol. El forro puede consistir en un recipiente de ensayo al que se ha retirado el fondo. La aplicación debe efectuarse a una temperatura de 20 ± 2 °C y, en el caso de las soluciones, emulsiones o dispersiones acuosas, la tasa de aplicación de agua será de entre 600 y 800 μl/m2. La tasa de aplicación debe comprobarse utilizando una técnica de calibración apropiada. Las formulaciones especiales, como gránulos o preparaciones para semillas, deben aplicarse de forma coherente con la utilización agrícola.
24.
Los recipientes de ensayo deben quedar descubiertos durante una hora para que puedan evaporarse los eventuales disolventes volátiles asociados con la aplicación de la sustancia problema. Debe tenerse cuidado para que en ese tiempo no se escapen las lombrices de los recipientes de ensayo.
PROCEDIMIENTO
Grupos de ensayo y controles
25.
Se recomienda una carga de 10 lombrices de tierra en 500 — 600 g de peso seco de suelo artificial (es decir, 50 a 60 g de suelo por lombriz). Si se utilizan cantidades mayores de suelo, como podría ser el caso si se ensayan plaguicidas con modos de aplicación especiales, tales como preparaciones para semillas, debe mantenerse la carga de 50 - 60 g de suelo por lombriz aumentando el número de lombrices. Se preparan diez lombrices para cada recipiente de control y de tratamiento. Las lombrices se lavan con agua y se escurren; después se ponen en papel absorbente durante un breve período para eliminar el exceso de agua.
26.
A fin de evitar errores sistemáticos en la distribución de las lombrices entre los recipientes de ensayo, la homogeneidad de la población de estudio debe determinarse pesando individualmente 20 lombrices muestreadas aleatoriamente de la población de la que deben tomarse las lombrices de ensayo. Una vez garantizada la homogeneidad, los lotes de lombrices se seleccionan, se pesan, y se asignan a los recipientes de ensayo utilizando un procedimiento de aleatorización. Tras la adición de las lombrices de ensayo, debe medirse el peso de cada recipiente de ensayo a fin de asegurarse de que hay un peso inicial que puede utilizarse como base para el control del contenido de humedad del suelo a lo largo de todo el ensayo, como se describe en el punto 30. Los recipientes de ensayo se cubren entonces, como se describe en el punto 9, y se colocan en la cámara de ensayo.
27.
Se preparan controles adecuados para cada uno de los métodos de aplicación de la sustancia problema descritos en los puntos 18 a 24. Para preparar los controles se siguen los procedimientos pertinentes descritos, salvo que no se añade la sustancia problema. Por lo tanto, en su caso, se utilizan en los controles disolventes orgánicos, arena de cuarzo u otros vehículos, en concentraciones y cantidades iguales a las utilizadas en los tratamientos. Cuando se utiliza un disolvente u otro vehículo para añadir la sustancia problema, debe prepararse y someterse a ensayo un control adicional sin sustancia problema y sin vehículo para asegurarse de que el vehículo no tiene ninguna incidencia sobre el resultado.
Condiciones del ensayo
28.
La temperatura de ensayo es de 20 ± 2 °C. El ensayo se efectúa en ciclos controlados de luz y oscuridad (preferentemente 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad) con una iluminación de 400 a 800 lux en la zona de los recipientes de ensayo.
29.
Los recipientes de ensayo no se airean durante el ensayo, pero el diseño de las tapas de los recipientes de ensayo debe permitir los intercambios gaseosos, al tiempo que limita la evaporación de la humedad (véase el punto 9).
30.
Se controla que el contenido de agua del sustrato del suelo en los recipientes de ensayo se mantenga constante a lo largo de todo el ensayo, pesando periódicamente los recipientes de ensayo (menos sus tapas). Las pérdidas se compensan en la medida de lo necesario con agua desionizada. El contenido de agua no debe variar en más de un 10 % respecto al del inicio del ensayo.
Alimentación
31.
Se considera aceptable cualquier alimento del que se haya demostrado que tiene una calidad adecuada para al menos mantener el peso de las lombrices durante el ensayo. La experiencia ha demostrado que la harina de avena y el estiércol de caballo o de vaca son un alimento adecuado. Se deben realizar controles para garantizar que las vacas o caballos de los que se obtiene el estiércol no son objeto de tratamiento con medicamentos o sustancias, tales como factores de crecimiento, nematicidas o productos veterinarios similares, que puedan afectar negativamente a las lombrices durante el ensayo. Se recomienda recoger directamente el estiércol de vaca, ya que la experiencia ha demostrado que el estiércol de vaca disponible en el comercio para utilizarse como abono de jardín puede tener efectos negativos para las lombrices. El estiércol debe secarse al aire, molerse finamente y pasteurizarse antes de su utilización.
32.
Cada lote nuevo de alimentos debe darse a un cultivo de lombrices aparte antes de su utilización en un ensayo para asegurarse de que es de calidad aceptable. El crecimiento y la producción de capullos no deben reducirse respecto a las lombrices mantenidas en un sustrato que no contiene el nuevo lote de alimentos [en las condiciones descritas en el método de ensayo C.8 (4)].
33.
Se facilita alimentación por primera vez un día después de la adición de las lombrices y la aplicación de la sustancia problema al suelo. Aproximadamente 5 g de alimento se reparten por la superficie del suelo de cada recipiente y se humedecen con agua desionizada (unos 5 o 6 ml por recipiente). Posteriormente, se suministra el alimento una vez por semana durante el período de ensayo de cuatro semanas. Si quedan alimentos sin consumir, debe reducirse la ración alimentaria con el fin de evitar el crecimiento de hongos o enmohecimiento. Los adultos se retiran del suelo el día 28 del ensayo. A continuación se administran otros 5 g de alimento a cada recipiente de ensayo. No se vuelve a aportar alimento durante las cuatro semanas restantes del ensayo.
Selección de las concentraciones de ensayo
34.
El conocimiento previo de la toxicidad de la sustancia problema debe ayudar a la hora de seleccionar las concentraciones de ensayo apropiadas, por ejemplo gracias a un ensayo de toxicidad aguda (4) o a un estudio de determinación del intervalo. Cuando sea necesario, se llevará a cabo un ensayo de determinación del intervalo con, por ejemplo, cinco concentraciones de ensayo, de 0,1, 1,0, 10, 100 y 1 000 mg/kg (peso seco de suelo). Es suficiente con una sola réplica para cada tratamiento y control. La duración del ensayo de determinación del intervalo es de dos semanas y al final del mismo se evalúa la mortalidad.
Diseño experimental
35.
Al no poder prescribir para el ensayo la aplicación de un único valor muestral que sirva de resumen, este método de ensayo prevé la determinación de la NOEC y la ECx. Es probable que las autoridades reguladoras exijan la NOEC en un futuro previsible. En el futuro inmediato es posible que se adopte una utilización más amplia de la ECx, como consecuencia de consideraciones estadísticas y ecológicas. Por tanto, se proponen tres diseños sobre la base de las recomendaciones derivadas de una prueba interlaboratorios realizada sobre un método de ensayo de reproducción de enquitreidos (17).
36.
Al determinar la gama de concentraciones, debe tenerse en cuenta lo siguiente:
—
para la determinación de la NOEC deben someterse a ensayo al menos cinco/doce concentraciones en serie geométrica; se recomienda utilizar cuatro réplicas de cada concentración de ensayo más ocho controles; las concentraciones deben estar espaciadas por un factor que no exceda de 2,0;
—
para la determinación de los valores de ECx (por ejemplo, EC10, EC50), se recomienda un número adecuado de concentraciones que causen al menos cuatro respuestas medias significativamente diferentes desde el punto de vista estadístico a estas concentraciones; se recomienda utilizar al menos dos réplicas de cada concentración de ensayo y seis réplicas de control; el factor de espaciado puede variar, es decir, ser igual o inferior a 1,8 en el intervalo de efecto previsto y superior a 1,8 a concentraciones superiores e inferiores;
—
un enfoque combinado permite la determinación tanto de la NOEC como de la ECx; deben utilizarse ocho concentraciones de tratamiento en progresión geométrica; se recomienda utilizar cuatro réplicas de cada tratamiento más ocho controles; las concentraciones deben estar espaciadas por un factor que no exceda de 1,8.
Duración del ensayo y mediciones
37.
El día 28 se observan y recuentan las lombrices adultas vivas. También debe registrarse cualquier anomalía que se observe en el comportamiento (por ejemplo, si se vuelven incapaces de excavar en el suelo o si se quedan inmóviles) y en la morfología (por ejemplo, heridas abiertas). A continuación, se retiran y se pesan todas las lombrices adultas de los recipientes de ensayo. La transferencia del suelo que contiene las lombrices a una bandeja limpia antes de la evaluación puede facilitar la búsqueda de las lombrices adultas. Las lombrices extraídas del suelo deben lavarse (con agua desionizada) antes de pesarse y se elimina el exceso de agua poniendo brevemente las lombrices en papel de filtro. Las eventuales lombrices que no se encuentren en esta fase se registrarán como muertas, ya que es de suponer que estas lombrices hayan muerto y se hayan descompuesto antes de la evaluación.
38.
Si el suelo se ha retirado de los recipientes, ahora se devuelve a ellos (sin las lombrices adultas, pero todavía con los eventuales capullos producidos). El suelo se incuba a continuación durante cuatro semanas adicionales en las mismas condiciones de ensayo, salvo que la alimentación solo tiene lugar una vez al comienzo de esta fase del ensayo (véase el punto 33).
39.
Al final del segundo período de cuatro semanas, se determinan el número de juveniles nacidos de los capullos en el suelo de ensayo y el número de capullos, mediante los procedimientos descritos en el apéndice 5. También deben registrarse a lo largo del ensayo todos los signos de daño o deterioro de las lombrices.
Ensayo límite
40.
Si no se observan efectos a la concentración máxima utilizada en el ensayo de determinación del intervalo (es decir, 1 000 mg/kg), el ensayo de reproducción se realizaría como ensayo límite, con una concentración de ensayo de 1 000 mg/kg. El ensayo límite ofrecerá la oportunidad de demostrar que la NOEC para la reproducción es superior a la concentración límite, reduciendo al mínimo el número de lombrices utilizadas en el ensayo. Deben utilizarse ocho réplicas tanto para el suelo tratado como para el control.
DATOS E INFORME
Tratamiento de los resultados
41.
A pesar de que se da una visión de conjunto en el apéndice 6, en este método de ensayo no se incluye ninguna orientación estadística definitiva para el análisis de los resultados del ensayo.
42.
Un parámetro es la mortalidad. Sin embargo, también deben registrarse los cambios en el comportamiento (por ejemplo, si se vuelven incapaces de excavar en el suelo o si se quedan inmóviles junto a la pared de vidrio del recipiente de ensayo) y en la morfología (p. ej., si tienen heridas abiertas) de las lombrices adultas, además de la eventual presencia de juveniles. Para determinar la LC50 debe aplicarse en principio el análisis de probit (18) o la regresión logística. No obstante, en aquellos casos en que este método de análisis no sea adecuado (por ejemplo, si se dispone de menos de tres concentraciones con mortalidades parciales) pueden utilizarse métodos alternativos. Entre estos métodos pueden figurar el de medias móviles (19), el método de Spearman-Karber recortado (20) o una interpolación simple (p. ej., media geométrica de LC0 y LC100, calculada multiplicando la raíz cuadrada de LC0 por LC100).
43.
El otro parámetro es la fecundidad (es decir, el número de juveniles producidos). Sin embargo, como en el ensayo de determinación del intervalo, deben registrarse en el informe final todos los demás signos de naturaleza nociva. El análisis estadístico requiere que se calculen la media aritmética Formula
y la desviación típica por grupo de tratamiento y por grupo de control en cuanto a la reproducción.
44.
Si se ha realizado el análisis de la varianza, la desviación típica, s, y los grados de libertad, df, pueden sustituirse respectivamente por la estimación de la varianza “agrupada” obtenida del ANOVA y por sus grados de libertad, siempre que la varianza no dependa de la concentración. En este caso, se utilizarán las distintas varianzas de los controles y de los grupos tratados. Estos valores son calculados en general por programas estadísticos comerciales utilizando los resultados de cada recipiente como réplicas. Si la “agrupación” de datos de los controles negativo y de disolvente parece más razonable que hacer las pruebas frente a uno solo de estos conjuntos, debe comprobarse que no son significativamente diferentes (sobre pruebas apropiadas véanse el punto 47 y el apéndice 6).
45.
La realización de más pruebas estadísticas y de deducciones depende de si los valores de las réplicas se distribuyen normalmente y son homogéneas en lo que respecta a su varianza.
Estimación de la NOEC
46.
Es preferible la aplicación de ensayos potentes. Se debería utilizar la información previa obtenida, por ejemplo a partir de la experiencia con ensayos interlaboratorios u otros datos históricos, sobre si los datos presentan una distribución aproximadamente normal. Es más crítica la homogeneidad de la varianza (homoscedasticidad). La experiencia indica que la varianza suele aumentar cuando sube la media. En estos supuestos, una transformación de los datos podría llevar a la homoscedasticidad. Sin embargo, esta transformación debe basarse en la experiencia con datos históricos, más que en los datos objeto de la investigación. Con datos homogéneos, deben llevarse a cabo pruebas t de comparación múltiple, como la prueba de Williams (α = 0,05, unilateral) (21) (22) o, en algunos casos, la prueba de Dunnett (23) (24). Cabe señalar que, en caso de replicación desigual, los valores t del cuadro deberán corregirse según lo sugerido por Dunnett y Williams. En ocasiones, debido a una gran variación, las respuestas no aumentan o disminuyen regularmente. En este caso de fuerte desviación respecto a la monotonicidad, es más conveniente la prueba de Dunnett. En caso de que haya desviaciones con respecto a la homoscedasticidad, puede resultar razonable analizar más estrechamente los posibles efectos sobre las varianzas, a fin de decidir si las pruebas t pueden aplicarse sin perder mucha potencia (25). De forma alternativa, puede aplicarse una prueba U de comparación múltiple, por ejemplo la prueba U de Bonferroni según Holm (26), o, cuando estos datos presenten heteroscedasticidad pero por lo demás sean coherentes con una relación dosis-respuesta monótona subyacente, otra prueba no paramétrica [por ejemplo, una prueba de Jonckheere-Terpstra (27) (28) o Shirley (29) (30)] y, en general, se dará preferencia a estas pruebas frente a las pruebas t de varianza desigual (véase también el esquema del apéndice 6).
47.
En caso de que se haya realizado un ensayo límite y se cumplan los requisitos previos de procedimientos de ensayos paramétricos (normalidad, homogeneidad), puede utilizarse la prueba t de Student pareada o, si no, el procedimiento de la prueba U de Mann-Whitney (31).
Estimación de ECx
48.
Para calcular cualquier valor de ECx se utilizan las medias por tratamiento para el análisis de regresión (lineal o no lineal), tras haber obtenido una función dosis-respuesta adecuada. En relación con el crecimiento de las lombrices como respuesta continua, pueden calcularse los valores de ECx utilizando el análisis de regresión adecuado (32). Entre las funciones adecuadas para los datos cuánticos (mortalidad/supervivencia) y número de descendientes producidos están las funciones sigmoideas normales, logísticas o de Weibull, con entre dos y cuatro parámetros, algunas de las cuales pueden modelizar también respuestas horméticas. Si la función dosis-respuesta se ha ajustado mediante análisis de regresión lineal, debe determinarse con el análisis de regresión un r2 (coeficiente de determinación) y/o una pendiente significativos antes de estimar la ECx mediante la inserción de un valor correspondiente a x % de la media del control en la ecuación encontrada con el análisis de regresión. Se calculan límites de confianza del 95 % con arreglo al método de Fieller [citado en Finney (18)] u otros métodos adecuados modernos.
49.
Otra posibilidad consiste en modelizar la respuesta como porcentaje o proporción del parámetro del modelo que se interpreta como la respuesta media del control. En estos casos, la curva sigmoidea normal (logística, Weibull) puede ajustarse a menudo fácilmente a los resultados utilizando el método de regresión de probit (18). En estos casos, la función de ponderación ha de ajustarse para respuestas métricas según indica Christensen (33). No obstante, si se ha observado hormesis, el análisis de probit debe ser sustituido por una función logística o de Weibull de cuatro parámetros, ajustada por un método de regresión no lineal (34). Si no puede ajustarse a los datos una función dosis-respuesta adecuada, podrán utilizarse métodos alternativos para calcular el valor de ECx y sus límites de confianza, tales como el método de medias móviles de Thompson (19) y el de Spearman-Karber recortado (20).
INFORME DEL ENSAYO
50.
El informe del ensayo deberá incluir la información siguiente:
Sustancia problema:
—
descripción definitiva de la sustancia problema, lote de fabricación, lote de acondicionamiento y número CAS, pureza;
—
propiedades de la sustancia problema (p. ej., log Kow, hidrosolubilidad, presión de vapor, constante de Henry (H) e información sobre el destino y el comportamiento).
Organismos de ensayo:
—
animales utilizados en el ensayo: especie, nombre científico, origen de los organismos y condiciones de cría,
—
edad, intervalo de tamaños (masas) de los organismos de ensayo.
Condiciones del ensayo:
—
datos de la preparación del suelo para el ensayo;
—
capacidad máxima de retención de agua del suelo;
—
descripción de la técnica utilizada para aplicar la sustancia problema al suelo;
—
datos de las sustancias auxiliares utilizadas para la administración de la sustancia problema;
—
datos de calibrado para el equipo de rociado, si procede;
—
descripción del diseño experimental y del procedimiento;
—
tamaño de los recipientes de ensayo y volumen del suelo de ensayo;
—
condiciones del ensayo: intensidad luminosa, duración de los ciclos de luz y oscuridad, temperatura;
—
descripción del régimen alimentario, tipo y cantidad del alimento utilizado en el ensayo, fechas de alimentación;
—
pH y contenido de agua del suelo al inicio y al final del ensayo.
Resultados del ensayo:
—
mortalidad de los adultos (%) en cada recipiente de ensayo al final de las cuatro primeras semanas del ensayo;
—
masa total de los adultos al comienzo del ensayo en cada recipiente de ensayo;
—
cambios en el peso corporal de los adultos vivos (% del peso inicial) de cada recipiente de ensayo tras las cuatro primeras semanas del ensayo;
—
número de juveniles producidos en cada recipiente de ensayo al final del ensayo;
—
descripción de los síntomas manifiestos o patológicos, o de los cambios claros de comportamiento;
—
resultados obtenidos con la sustancia de referencia;
—
la LC50, la NOEC y/o ECx (p. ej., EC50, EC10) para la reproducción si algunas de ellas son aplicables con intervalos de confianza, y un gráfico del modelo ajustado utilizado para su cálculo, todas las informaciones y observaciones útiles para la interpretación de los resultados;
—
representación gráfica de la relación dosis-respuesta;
—
resultados aplicables a cada recipiente de ensayo;
Las eventuales desviaciones respecto a los procedimientos descritos en el presente método de ensayo y cualquier acontecimiento inusual ocurrido en el ensayo.
BIBLIOGRAFÍA
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(4)
Capítulo C.8 del presente anexo. Ensayo de toxicidad aguda para gusanos de tierra.
(5)
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(6)
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(14)
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(16)
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Apéndice 1
Definiciones
En este método de ensayo se aplican las siguientes definiciones:
Sustancia : sustancia o mezcla.
ECx (concentración con efecto al x %): concentración que provoca el x % de un efecto sobre los organismos de ensayo dentro de un determinado período de exposición cuando se compara con un control. Por ejemplo, una EC50 es una concentración de la que se estima que causa un efecto sobre un parámetro de un ensayo en el 50 % de una población expuesta a lo largo de un determinado período de exposición. En este ensayo, las concentraciones con efecto se expresan en masa de sustancia problema por masa seca del suelo de ensayo o en masa de sustancia problema por unidad de superficie del suelo.
LC0 (concentración no letal): concentración de una sustancia problema que no mata a ninguno de los organismos de ensayo expuestos dentro de un determinado período de tiempo. En este ensayo la LC0 se expresa en masa de sustancia problema por masa seca del suelo de ensayo.
LC50 (concentración letal mediana): concentración de una sustancia problema que mata al 50 % de los organismos de ensayo expuestos dentro de un determinado período de tiempo. En este ensayo, la LC50 se expresa en masa de sustancia problema por masa seca del suelo de ensayo o en masa de sustancia problema por unidad de superficie del suelo.
LC100 (concentración totalmente letal): concentración de una sustancia problema que mata al 100 % de los organismos de ensayo expuestos dentro de un determinado período de tiempo. En este ensayo la LC100 se expresa en masa de sustancia problema por masa seca del suelo de ensayo.
LOEC (concentración mínima con efecto observado): concentración mínima de la sustancia problema que tiene un efecto estadísticamente significativo (p < 0,05). En este ensayo, la LOEC se expresa en masa de sustancia problema por masa seca del suelo de ensayo o en masa de sustancia problema por unidad de superficie del suelo. Todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC deben presentar normalmente un efecto que es estadísticamente diferente del del control. Cualquier desviación respecto de lo anterior debe justificarse en el informe de ensayo.
NOEC (concentración sin efecto observado): concentración más elevada de la sustancia problema inmediatamente por debajo de la LOEC a la que no se observa ningún efecto. En este ensayo, la concentración correspondiente a la NOEC no ejerce ningún efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro de un determinado período de exposición en comparación con el control.
Tasa de reproducción : número medio de lombrices juveniles producidas por un número de lombrices adultas durante el período de ensayo.
Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.
Apéndice 2
Determinación de la capacidad máxima de retención de agua del suelo
Se ha comprobado que el siguiente método es adecuado para determinar la capacidad máxima de retención de agua del suelo. Se describe en el anexo C de la norma ISO DIS 11268-2 (1).
Se recoge una determinada cantidad (p. ej., 5 g) del sustrato de suelo de ensayo, utilizando un dispositivo adecuado de muestreo (tubo de barrena, etc.). Se cubre el fondo del tubo con un trozo de papel de filtro, se llena de agua y se coloca a continuación en un soporte en un baño de agua. El tubo debe sumergirse gradualmente hasta que el nivel del agua esté por encima del extremo superior del suelo. A continuación, se debe dejar en el agua alrededor de tres horas. Dado que no puede retenerse toda el agua absorbida por los capilares del suelo, la muestra de suelo debe dejarse escurrir durante un período de dos horas, colocando el tubo en un lecho de arena de cuarzo finamente molida muy húmeda y contenida en un recipiente tapado (para evitar que se seque). La muestra debe pesarse y secarse hasta obtener una masa constante a 105 oC. La capacidad de retención de agua (WHC) puede calcularse de la manera siguiente:
Formula
donde:
S
=
masa del sustrato saturado de agua + masa del tubo + masa del papel de filtro
T
=
tara (masa del tubo + masa del papel de filtro)
D
=
masa seca del sustrato
BIBLIOGRAFÍA:
(1)
ISO (Organización Internacional de Normalización) (1996). Calidad del suelo: Efectos de los contaminantes sobre las lombrices de tierra (Eisenia fetida). Parte 2: Determinación de los efectos en la reproducción, no 11268-2. ISO, Ginebra.
Apéndice 3
Determinación del pH del suelo
El siguiente método de determinación del pH de un suelo se basa en la descripción recogida en la norma ISO DIS 10390: Calidad del suelo. Determinación del pH (1).
Una determinada cantidad de suelo se seca a temperatura ambiente durante al menos 12 horas. A continuación se hace una suspensión del suelo (con al menos 5 gramos de este) en cinco veces su volumen de una solución 1 M de cloruro de potasio de grado analítico (KCl) o de una solución 0,01 M de cloruro de calcio de grado analítico (CaCl2). Después de agitarla enérgicamente durante 5 minutos, se deja reposar la suspensión desde 2 horas como mínimo hasta 24 horas como máximo. El pH de la fase líquida se mide a continuación utilizando un pH-metro, que habrá sido calibrado antes de cada medición con una serie adecuada de soluciones amortiguadoras (p. ej., a un pH de 4,0 y 7,0).
BIBLIOGRAFÍA:
(1)
ISO (Organización Internacional de Normalización) (1994). Calidad del suelo. Determinación del pH, no 10390. ISO, Ginebra.
Apéndice 4
Cultivo de Eisenia fetida / Eisenia andrei
La cría se realiza preferentemente en una cámara climatizada a 20 °C ± 2 °C. A esta temperatura y con el aporte de alimentos suficientes, las lombrices maduran al cabo de unos 2 o 3 meses.
Ambas especies pueden cultivarse con una amplia gama de residuos animales. El medio de cría recomendado es una mezcla 50:50 de estiércol de caballo o de vaca y de turba. Se deben realizar controles para garantizar que las vacas o caballos de los que se obtiene el estiércol no son objeto de tratamiento con medicamentos o sustancias, tales como factores de crecimiento, nematicidas o productos veterinarios similares, que puedan afectar negativamente a las lombrices durante el ensayo. Se recomienda recoger directamente estiércol de vaca procedente de una fuente “ecológica”, ya que la experiencia ha demostrado que el estiércol disponible en el comercio para utilizarse como abono de jardín puede tener efectos negativos para las lombrices. El medio debe tener un valor de pH aproximadamente entre 6 y 7 (ajustado con carbonato de calcio) y una conductividad iónica baja (menos de 6 mS/cm o menos del 0,5 % de concentración salina), y no debe presentar una contaminación excesiva de amoníaco ni de orina animal. El sustrato debe estar húmedo, pero no demasiado mojado. Son adecuadas las cajas de cría de 10 a 50 l de capacidad.
Para obtener lombrices homogéneas en cuanto a su edad y masa, lo mejor es iniciar el cultivo con capullos. Una vez establecido el cultivo, se mantiene colocando lombrices adultas en una caja de cría con sustrato fresco durante un plazo de 14 a 28 días, a fin de permitir la producción de nuevos capullos. A continuación, se retiran los adultos, y los juveniles obtenidos de los capullos se utilizan como base para el cultivo siguiente. Las lombrices se alimentan de forma continua con residuos animales y se trasladan a sustrato fresco de vez en cuando. La experiencia ha demostrado que la harina de avena o el estiércol de caballo o de vaca finamente molido y secado al aire son un alimento adecuado. Hay que asegurarse de que las vacas o caballos de los que se obtiene el estiércol no son objeto de tratamiento con medicamentos o sustancias, tales como factores de crecimiento, que puedan afectar negativamente a las lombrices durante el cultivo a largo plazo. Las lombrices nacidas de los capullos se utilizan en los ensayos cuando tienen entre 2 y 12 meses de edad y se consideran adultas.
Puede considerarse que las lombrices están sanas si se mueven a través del sustrato, no intentan abandonarlo y se reproducen continuamente. Es signo de agotamiento del sustrato que las lombrices se muevan muy lentamente y tengan el extremo posterior de color amarillo. En este caso, se recomienda el aporte de sustrato fresco y/o una reducción de la densidad de población.
Apéndice 5
Técnicas de recuento de las lombrices juveniles nacidas de los capullos
La selección manual de las lombrices presentes en el sustrato del suelo es muy lenta. Se recomiendan, por lo tanto, dos métodos alternativos:
a)
Los recipientes de ensayo se colocan en un baño de agua, inicialmente a la temperatura de 40 oC pero que va aumentando hasta los 60 °C. Tras un período de 20 minutos aproximadamente, las lombrices juveniles deben aparecer en la superficie del suelo, de donde se pueden retirar fácilmente y contar.
b)
El suelo de ensayo puede lavarse a través de un tamiz usando el método elaborado por van Gestel et al. (1), siempre que la turba y el estiércol o harina de avena añadidos al suelo estuvieran molidos hasta formar un polvo fino. Se ponen uno encima de otro dos tamices cuya luz de malla sea de 0,5 mm (diámetro 30 cm). El contenido de un recipiente de ensayo se lava a través de los tamices con una fuerte corriente de agua del grifo, dejando las lombrices jóvenes y los capullos principalmente en el tamiz superior. Es importante señalar que la totalidad de la superficie del tamiz superior debe mantenerse húmeda durante esta operación, de forma que las lombrices juveniles floten en una película de agua, lo que les impide deslizarse a través de los poros del tamiz. Los mejores resultados se obtienen utilizando una alcachofa de ducha.
Una vez que todo el sustrato del suelo se ha lavado a través del tamiz, los juveniles y los capullos se pasan a una cubeta arrastrándolos con agua desde el tamiz superior. El contenido de la cubeta se deja reposar para que los capullos vacíos floten en la superficie del agua y los capullos llenos y las lombrices juveniles vayan al fondo. El agua de la cubeta puede decantarse y las lombrices juveniles y los capullos se transfieren a una placa de Petri que contenga un poco de agua. Las lombrices pueden retirarse para su recuento con una aguja o unas pinzas.
La experiencia ha demostrado que el método a) es más adecuado para la extracción de lombrices juveniles, que podrían ser arrastradas, incluso a través de un tamiz de 0,5 mm.
Siempre debe determinarse la eficiencia del método utilizado para retirar las lombrices (y los capullos cuando proceda) del sustrato de suelo. En el caso de que los juveniles se recojan mediante la técnica de clasificación manual, es recomendable realizar la operación dos veces con todas las muestras.
Bibliografía:
(1)
Van Gestel, C.A.M., W.A. van Dis, E.M. van Breemen, P.M. Sparenburg (1988). Comparison of two methods determining the viability of cocoons produced in earthworm toxicity experiments. Pedobiologia 32:367-371.
Apéndice 6
Resumen de la evaluación estadística de los datos (determinación de la NOEC) Image
C.34. DETERMINACIÓN DE LA INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE BACTERIAS ANAEROBIAS. REDUCCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE GAS DE LODOS (DE DEPURADORA) EN CONDICIONES ANAERÓBICAS
INTRODUCCIÓN
1.
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 224 (2007). Las sustancias vertidas al medio acuático pasan por zonas tanto aeróbicas como anaeróbicas, en las que pueden degradarse y/o pueden inhibir la actividad bacteriana; en algunos casos pueden permanecer en las zonas anaeróbicas sin alterarse durante décadas o más aún. En el tratamiento de las aguas residuales, la primera fase, de sedimentación primaria, es aeróbica en el líquido sobrenadante y anaeróbica en el lodo subyacente. Posteriormente, en la segunda fase, hay una zona aeróbica en el tanque de aireación del lodo activado y una zona anaeróbica en el lodo subyacente en el tanque de sedimentación secundaria. El lodo de estas dos fases se somete normalmente a tratamiento anaeróbico, con producción de metano y dióxido de carbono que se utilizan normalmente para la producción de electricidad. En el medio ambiente en general, es probable que las sustancias que alcanzan los sedimentos de las bahías, los estuarios y el mar permanezcan en estas zonas anaeróbicas de forma indefinida si no son biodegradables. Algunas sustancias llegan en grandes proporciones preferentemente a estas zonas debido a sus propiedades físicas, tales como su baja hidrosolubilidad o su alta adsorción a los sólidos en suspensión, así como a que no pueden biodegradarse en condiciones aeróbicas.
2.
Si bien es deseable que las sustancias vertidas al medio ambiente sean biodegradables en condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas, es esencial que tales sustancias no inhiban la actividad de los microorganismos de ninguna de las zonas. En el Reino Unido ha habido algunos casos de inhibición completa de la producción de metano debidos, por ejemplo, a la presencia de pentaclorofenol en los vertidos industriales, lo que ha implicado el transporte, muy costoso, de los lodos inhibidos desde los digestores hasta sitios “seguros”, y la importación de lodos de digestión no contaminados procedentes de instalaciones próximas. Pero ha habido muchos casos de alteración menos grave de la digestión por algunas otras sustancias, incluidos los hidrocarburos alifáticos halogenados (limpieza en seco) y los detergentes, con reducción significativa de la eficiencia de la digestión.
3.
Solo un método de ensayo, el C.11 (1), se refiere a la inhibición de la actividad bacteriana (respiración del lodo activado) y evalúa el efecto de las sustancias problema sobre la tasa de consumo de oxígeno en presencia de sustrato. El método ha sido ampliamente utilizado para la detección temprana de posibles efectos nocivos de las sustancias sobre el tratamiento aeróbico de las aguas residuales, así como para indicar las concentraciones no inhibitorias de las sustancias problema utilizadas en los diferentes ensayos de biodegradabilidad. El método de ensayo C.43 (2) ofrece una oportunidad limitada para determinar la toxicidad de una sustancia problema en cuanto a la producción de gas por lodos anaeróbicos, diluidos a una décima parte de su concentración normal de sólidos para que se pueda alcanzar la precisión requerida en la evaluación del porcentaje de biodegradación. Como el lodo diluido podría ser más sensible a las sustancias inhibidoras, el grupo de la ISO decidió preparar un método que utilizara lodo sin diluir. Se estudiaron al menos tres textos (de Dinamarca, Alemania y el Reino Unido) y, por último, se prepararon dos normas ISO, una con lodos sin diluir, la ISO 13641-1 (3) y otra con dilución a una centésima, la ISO 13641-2 (4), para representar fangos y sedimentos con bajas poblaciones de bacterias. Ambos métodos han sido sometidos a un ensayo interlaboratorios (5); la parte 1 se confirmó como norma aceptable, pero no hubo consenso acerca de la parte 2. El Reino Unido consideraba que el método requiere más investigación, ya que una proporción significativa de los participantes informaron de una producción de gas muy escasa o nula, en parte debido a que el porcentaje del espacio para el gas era demasiado elevado (del 75 %) para una sensibilidad óptima.
4.
En trabajos anteriores realizados en el Reino Unido (6) (7) se describe un método manométrico que utiliza lodo de digestión sin diluir, más lodos de depuradora sin tratar como sustrato, en frascos de 500 ml; el equipo era pesado y resultaba nauseabundo el mal olor de los lodos sin tratar. Más tarde, Wilson et al. (10) aplicaron con éxito el equipo más compacto y cómodo de Shelton y Tiedje (8), desarrollado por Battersby y Wilson (9). Kawahara et al. (11) prepararon con éxito lodos más homogéneos en el laboratorio para su uso en pruebas de biodegradabilidad anaeróbica y de inhibición en relación con una serie de sustancias. Asimismo, el lodo sin tratar se sustituyó como sustrato para llevar a cabo un ensayo con lodo anaeróbico diluido a una centésima o con fangos, sedimentos, etc., de baja actividad bacteriana.
5.
Este método puede proporcionar información útil para predecir el efecto probable de una sustancia problema sobre la producción de gas en digestores anaeróbicos. Sin embargo, solamente mediante ensayos más largos que simulen de forma más próxima el funcionamiento de los digestores de trabajo cabe indicar si puede producirse la adaptación de los microorganismos a la sustancia problema o si es posible que las sustancias que puedan absorberse y adsorberse en los lodos lleguen a generar una concentración tóxica en un plazo más largo de lo que permite este ensayo.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
6.
Unas alícuotas de una mezcla de lodos de digestión anaeróbica (con entre 20 g/l y 40 g/l de sólidos totales) y una solución de sustrato degradable se incuban solas y simultáneamente con una gama de concentraciones de la sustancia problema en recipientes sellados durante un plazo de hasta 3 días. La cantidad de gas producido (metano y dióxido de carbono) se mide por el aumento de presión (Pa) en los frascos. El porcentaje de inhibición de la producción de gas que se debe a las distintas concentraciones de la sustancia problema se calcula a partir de las cantidades producidas en los respectivos frascos de ensayo y de control. Las concentraciones (EC50 y con otro efecto) se calculan a partir de las gráficas del porcentaje de inhibición frente a la concentración de las sustancias problema o, más generalmente, su logaritmo.
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA
7.
Las sustancias problema deben utilizarse normalmente en la forma más pura fácilmente disponible, dado que las impurezas de ciertas sustancias, por ejemplo de los clorofenoles, pueden ser mucho más tóxicas que la sustancia problema en sí. No obstante, debe considerarse la necesidad de someter a ensayo las sustancias problema en la forma en que se producen o se comercializan. El uso de productos formulados no se recomienda en principio, pero puede ser adecuado en el caso de sustancias problema poco solubles. Entre las propiedades de la sustancia problema que deben conocerse se cuentan la solubilidad en agua y en algunos disolventes orgánicos, la presión de vapor, el coeficiente de adsorción, la hidrólisis y la biodegradabilidad en condiciones anaeróbicas.
APLICABILIDAD DEL MÉTODO
8.
El ensayo es aplicable a las sustancias tanto solubles como insolubles en agua, incluidas las sustancias volátiles. No obstante, ha de prestarse una atención especial a los materiales de baja hidrosolubilidad [véase la referencia (12)] y de alta volatilidad. Asimismo, pueden utilizarse inóculos procedentes de otras zonas anaeróbicas como, por ejemplo, fangos, suelos saturados o sedimentos. Los sistemas bacterianos anaerobios que se han expuesto previamente a sustancias tóxicas pueden adaptarse para mantener su actividad en presencia de sustancias xenobióticas. Los inóculos de sistemas bacterianos adaptados pueden mostrar mayor tolerancia a las sustancias problema en comparación con los inóculos procedentes de sistemas no adaptados.
SUSTANCIAS DE REFERENCIA
9.
Para comprobar el procedimiento se somete a ensayo una sustancia de referencia, preparando unos recipientes adecuados en paralelo como parte del proceso normal de ensayo; se ha comprobado que el 3,5-diclorofenol es un inhibidor estable de la producción anaeróbica de gas, así como del consumo de oxígeno por los lodos activados y de otras reacciones bioquímicas. Se ha demostrado que otras dos sustancias son más inhibidoras de la producción de metano que el 3,5-diclorofenol, a saber, el bis-tiocianato de metileno y el pentaclorofenol, pero los resultados con estas sustancias no se han validado. No se recomienda el pentaclorofenol por no estar fácilmente disponible en forma pura.
REPRODUCIBILIDAD DE LOS RESULTADOS
10.
En un ensayo interlaboratorios internacional (5) solo se encontró una reproducibilidad moderada en los valores de la EC50 entre los diez laboratorios participantes en cuanto al 3,5-diclorofenol y al ácido 2-bromo-etanosulfónico (el intervalo para la primera sustancia fue de 32 - 502 mg/l y para la segunda de 220 - 2 190 mg/l).
Número de laboratorios
En mg/l
En mg/g de lodo
Media
Desviación típica
CV (%)
Media
Desviación típica
CV (%)
3,5-Diclorofenol
10
153
158
103
5
4,6
92
Ácido 2-bromo-etanosulfónico
10
1 058
896
85
34
26
76
Datos de EC50 del ensayo interlaboratorios — lodo sin diluir
11.
Los elevados coeficientes de variación entre laboratorios reflejan en gran medida las diferencias en cuanto a la sensibilidad de los microorganismos de los lodos debidas a una eventual exposición previa o a la ausencia de exposición previa a la sustancia problema o a sustancias químicamente relacionadas con ella. La precisión con la que se determinó el valor de EC50 sobre la base de la concentración en el lodo era apenas mejor que la correspondiente al valor “volumétrico” (mg/l). Los tres laboratorios que comunicaron la precisión de sus valores de EC50 para el 3,5-diclorofenol indicaron unos coeficientes de variación mucho menores (22, 9 y 18 %, respectivamente para la EC50 en mg/g) que los de las medias del conjunto de los diez laboratorios. Las medias individuales de los tres laboratorios fueron de 3,1, 3,2 y 2,8 mg/g, respectivamente. Los valores menores y aceptables de los coeficientes de variación dentro de los laboratorios, frente a los valores mucho más elevados entre laboratorios, a saber, del 9 al 22 % frente al 92 %, indican que existen importantes diferencias en las propiedades de los distintos lodos.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Equipo
12.
Se utilizará material habitual de laboratorio, además de lo siguiente:
a)
Incubador, antichispas y con temperatura controlada a 35 °C ± 2 °C;
b)
Recipientes de ensayo de vidrio resistentes a la presión de un tamaño nominal adecuado (17), cada uno provisto de un tapón con revestimiento estanco a los gases, capaz de resistir unos 2 bar o 2 × 105 Pa (para el revestimiento puede utilizarse, p. ej., PTFE = politetrafluoroetileno). Se recomienda utilizar frascos de suero de vidrio de 125 ml de volumen nominal, con un volumen real de unos 160 ml, cerrados con tapones de suero (18) y cápsulas de aluminio, pero también pueden utilizarse sin problemas frascos de volumen total entre 0,1 y 1 litro;
c)
Manómetro de precisión (19) y agujas fijadas
La producción total de gas (metano y dióxido de carbono) se mide por medio de un manómetro adaptado para permitir la medición y la evacuación del gas producido. Un ejemplo de instrumento apropiado es un manómetro de precisión portátil conectado a una aguja de jeringa; una llave de tres vías estanca para los gases facilita la liberación del exceso de presión (apéndice 1). Es necesario mantener lo más bajo posible el volumen interno de la llave y de los tubos del transductor de presión, con el fin de que los errores introducidos por despreciar el volumen del equipo sean insignificantes;
d)
Recipientes aislados, para el transporte de los lodos de digestión;
e)
Llaves de presión de tres vías;
f)
Tamiz, con malla de 1 mm2;
g)
Depósito, para los lodos de digestión, frasco de polietileno de alta densidad o de vidrio, de 5 litros de capacidad, provisto de un agitador y de dispositivos para el paso de una corriente de gas nitrógeno (véase el punto 13) a través del espacio libre;
h)
Filtros de membrana (0,2 μm) para esterilizar el sustrato;
i)
Microjeringas, para la conexión, estanca a los gases, del transductor de presión [véase el punto 12, letra c)] al espacio libre de las botellas [véase el punto 12, letra b)]; también para añadir a los frascos los eventuales materiales de ensayo líquidos insolubles;
j)
Caja de guantes, opcional pero recomendada, con una ligera presión positiva de nitrógeno.
Reactivos
13.
Deben utilizarse siempre reactivos de pureza analítica. Debe utilizarse en todo el ensayo gas nitrógeno de pureza elevada, con un contenido en oxígeno inferior a 5μl/l.
Agua
14.
En caso de que sea necesario realizar una dilución en cualquier fase, utilícese agua desionizada desgasificada anteriormente. No es necesario controlar analíticamente esta agua, pero hay que velar por el mantenimiento periódico del equipo de desionización. También debe usarse agua desionizada para la preparación de las soluciones madre. Antes de la adición del inóculo anaerobio a cualquier solución o dilución de material problema, hay que asegurarse de que estas están exentas de oxígeno. Se hace pasando gas nitrógeno a través del agua de dilución (o a través de las diluciones) durante 1 hora antes de añadir el inóculo, o bien calentando el agua de dilución hasta el punto de ebullición y enfriándola a continuación a temperatura ambiente en una atmósfera exenta de oxígeno.
Lodo digerido
15.
Recoger lodos de digestión activos de un digestor de una depuradora de aguas residuales o, alternativamente, de un digestor de laboratorio, que trate lodos procedentes sobre todo de aguas residuales domésticas. Puede encontrarse en otras referencias (11) información práctica en relación con los lodos de digestores de laboratorio. Si está previsto utilizar un inóculo adaptado puede considerarse la posibilidad de recurrir a lodos de digestión procedentes de una depuradora de aguas residuales industriales. Para recoger los lodos han de utilizarse frascos de boca ancha, hechos de polietileno de alta densidad o de material similar que pueda expandirse. Hay que añadir lodo a los frascos de muestreo hasta que el nivel quede a alrededor de 1 cm del extremo superior de los frascos, cerrarlos herméticamente, de preferencia con una llave de seguridad [punto 12, letra e)], y ponerlos en recipientes aislados [punto 12, letra d)] para reducir el contraste de temperatura, hasta que se transfieran a un incubador mantenido a 35 °C ± 2 °C. Al abrir los frascos ha de tenerse precaución para liberar el exceso de presión de los gases aflojando cuidadosamente el cierre, o mediante una llave de liberación de presión de tres vías [punto 12, letra e)]. Es preferible utilizar el lodo en el plazo de unas horas desde su recogida; si no es así, puede conservarse a 35 °C ± 2 °C con el espacio libre lleno de nitrógeno, hasta un máximo de tres días, plazo en el que normalmente se pierde poca actividad.
Advertencia: Los lodos de digestión producen gases inflamables que presentan riesgo de incendio y de explosión; también contienen organismos potencialmente patógenos, por lo que es necesario tomar las precauciones adecuadas para manipular los lodos. Por motivos de seguridad, no deben utilizarse recipientes de vidrio para la recogida de lodos.
Inóculo
16.
Inmediatamente antes de utilizarlo, mezclar el lodo mediante agitación suave y pasarlo a través de un tamiz de 1 mm2 de malla [punto 12, letra f)] a un frasco adecuado [punto 12, letra g)] a través de cuyo espacio libre se hace pasar una corriente de nitrógeno. Se reserva una muestra para la medición de la concentración de sólidos secos totales [véase, por ejemplo, la norma ISO 11923 (13) o alguna norma equivalente de la UE]. En general, los lodos se utilizan sin dilución. La concentración de sólidos está generalmente entre el 2 y el 4 % (p/v). Compruébese el valor de pH del lodo y, si es necesario, ajústese a 7 ± 0,5.
Sustrato de ensayo
17.
Se disuelven 10 g de caldo nutritivo (p. ej., Oxoid), 10 g de extracto de levadura y 10 g de D-glucosa en agua desionizada, y se diluye hasta 100 ml. Se esteriliza por filtración a través de un filtro de membrana de 0,2 μm [punto 12, letra h)] y se utiliza inmediatamente o se conserva a 4 °C durante un plazo máximo de un día.
Sustancia problema
18.
Se prepara una solución madre distinta para cada sustancia problema hidrosoluble, que contenga, por ejemplo, 10 g/l de la sustancia en agua de dilución exenta de oxígeno (punto 14). Los volúmenes de estas soluciones madre deben ser adecuados para preparar las mezclas de reacción con concentraciones graduadas. Otra posibilidad consiste en preparar una serie de diluciones de cada solución madre de forma que el volumen añadido a los frascos de ensayo sea el mismo para cada concentración final necesaria. Hay que ajustar el pH de las soluciones madre a 7 ± 0,2, si es necesario;
19.
Para las sustancias problema insuficientemente hidrosolubles, consúltese la norma ISO 10634 (12) o alguna norma equivalente de la UE. Si se necesita utilizar un disolvente orgánico, evítense los disolventes tales como el cloroformo y el tetracloruro de carbono, de los que se sabe que inhiben fuertemente la producción de metano. Se prepara una disolución de la sustancia insoluble en agua a una concentración adecuada en un disolvente volátil adecuado como, por ejemplo, acetona o éter dietílico. Se añaden a frascos de ensayo vacíos [punto 12, letra b)] los volúmenes requeridos de la disolución en disolvente y se evapora el disolvente antes de añadir los lodos. Para otros tratamientos, utilícese la norma ISO 10634 (12) o norma equivalente de la UE, teniendo en cuenta que los eventuales tensioactivos que se utilicen para producir emulsiones pueden resultar inhibidores para la producción anaeróbica de gas. Si se considera que la presencia de disolventes orgánicos y emulsificantes produce artefactos, la sustancia problema puede añadirse directamente a la mezcla de ensayo en forma de polvo o líquido. Las sustancias volátiles y las sustancias líquidas insolubles en agua pueden inyectarse en frascos de suero inoculado, utilizando microjeringas [punto 12, letra i)].
20.
Se añade la sustancia problema a los frascos para obtener una serie geométrica de concentraciones como, por ejemplo, 500 mg/l, 250 mg/l, 125 mg/l, 62,5 mg/l, 31,2 mg/l and 15,6 mg/l. Si no se conoce el intervalo de toxicidad de sustancias similares, debe efectuarse en primer lugar un ensayo preliminar de determinación del intervalo, con las concentraciones de 1 000 mg/l, 100 mg/l y 10 mg/l para establecer el intervalo adecuado.
Sustancia de referencia
21.
Se prepara una solución acuosa de 3,5-diclorofenol (10 g/l) añadiendo gradualmente al sólido la cantidad mínima de solución de hidróxido de sodio 5 mol/l, agitando a la vez, hasta que se haya disuelto. Añadir a continuación agua de dilución desoxigenada (punto 14) hasta el volumen necesario; puede facilitarse la disolución con un baño de ultrasonidos. Pueden utilizarse otras sustancias de referencia cuando se ha obtenido el intervalo medio de la EC50 en al menos tres ensayos con diferentes inóculos (diferentes fuentes o diferentes momentos de recogida).
INTERFERENCIAS/ERRORES
22.
Resulta probable que algunos componentes de los lodos puedan reaccionar con inhibidores potenciales de manera que estos queden indisponibles para los microorganismos, con lo que se reduciría o incluso se anularía la inhibición. Además, en el supuesto de que los lodos ya contengan una sustancia inhibidora, se obtendrían resultados erróneos cuando dicha sustancia fuera objeto de ensayo. Aparte de estas posibilidades, se ha identificado una serie de factores que pueden dar lugar a resultados falsos. Se recogen en el apéndice 3, junto con métodos para eliminar o, al menos, reducir los errores.
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
23.
El número de réplicas necesarias depende del grado de precisión necesario para los índices de inhibición. Si los cierres de los frascos son suficientemente estancos a los gases durante el tiempo del ensayo, se debe utilizar un solo lote (al menos con tres réplicas) de frascos de ensayo a cada concentración exigida. Del mismo modo, se utiliza un solo lote de frascos con la sustancia de referencia y un solo conjunto de controles. No obstante, en el caso de que los cierres de los frascos sean fiables para únicamente una o unas pocas perforaciones, se debe utilizar un lote (por ejemplo, por triplicado) de frascos de ensayo para cada intervalo (t) en el que sea necesario disponer de resultados para todas las concentraciones de la sustancia problema que se hayan de someter a ensayo. Del mismo modo, se deben utilizar “t” lotes de frascos para la sustancia de referencia y para los controles.
24.
Se recomienda utilizar una caja de guantes [punto 12, letra j)]. Al menos 30 minutos antes de comenzar el ensayo, se pone en marcha un flujo de gas nitrógeno a través de una caja de guantes con todo el equipo necesario. Hay que velar por que la temperatura del lodo esté en el intervalo de 35 °C ± 2 °C durante la manipulación y el cerrado de los frascos.
Ensayo preliminar
25.
En caso de que se desconozca la actividad del lodo, se recomienda proceder a un ensayo preliminar. Se deben establecer controles para obtener unas concentraciones de sólidos de, por ejemplo, 10 g/l, 20 g/l y 40 g/l más el sustrato, pero sin sustancia problema. Asimismo, se deben utilizar distintos volúmenes de la mezcla de reacción para disponer de tres o cuatro proporciones de volumen del espacio libre y volumen del líquido. A partir de los resultados de los volúmenes de gas producidos a distintos intervalos de tiempo, se eligen las condiciones más adecuadas que permitan la obtención de dos mediciones diarias que indiquen volúmenes significativos de gases y liberación de presión al día con sensibilidad óptima (20) sin temor a las explosiones.
Adición de las sustancias problema
26.
Las sustancias problema hidrosolubles se añaden a los frascos de ensayo vacíos [punto 12, letra b)] como soluciones acuosas (punto 18). Se utilizan conjuntos de frascos al menos por triplicado para cada concentración de una serie de concentraciones (punto 20). En el caso de las sustancias problema poco solubles e insolubles, se inyectan soluciones de estas en disolventes orgánicos con una microjeringa en los frascos vacíos para obtener conjuntos de réplicas para cada concentración de una serie de cinco concentraciones de sustancia problema. Se evapora el disolvente mediante un chorro de gas nitrógeno sobre la superficie de las soluciones contenidas en los frascos de ensayo. Otra posibilidad consiste en añadir las sustancias sólidas insolubles pesándolas directamente en los frascos de ensayo.
27.
Si las sustancias líquidas insolubles y poco solubles en agua no se añaden utilizando un disolvente, se añaden directamente mediante una microjeringa a los frascos de ensayo tras la adición del inóculo y del sustrato de ensayo (véase el punto 30). Las sustancias problema volátiles pueden añadirse de la misma manera.
Adición de inóculo y sustrato
28.
Se agita un volumen adecuado del lodo de digestión tamizado (véase el punto 16) en un frasco de 5 litros [punto 12, letra g)], mientras se pasa una corriente de gas nitrógeno a través del espacio libre. Los frascos de ensayo que contienen soluciones acuosas o soluciones en disolventes evaporados de las sustancias problema se purgan con una corriente de gas nitrógeno durante unos dos minutos para extraer el aire. Se dispensan en los frascos de ensayo alícuotas de, por ejemplo, 100 ml del lodo bien mezclado, utilizando una pipeta de boca ancha o una probeta. Es esencial llenar la pipeta de una sola vez hasta el volumen exacto de lodo exigido, dada la facilidad de sedimentación de los sólidos del lodo. Si se toma una cantidad excesiva, se ha de vaciar la pipeta y volver a empezar.
29.
A continuación se añade suficiente cantidad de solución de sustrato (punto 17) para conseguir una concentración en la mezcla de 2 g/l de cada uno de los siguientes componentes: caldo nutritivo, extracto de levadura y D-glucosa, mientras que se sigue pasando nitrógeno. A continuación se muestra un ejemplo de lotes de ensayo.
Concentración final en masa de la sustancia problema en los frascos de ensayo
(mg/l)
Volumen de la sustancia problema
(ml)
Reactivos y medios
(ml)
Solución madre
a)10 g/l
punto 18
Solución madre
b)1 g/l
punto 18
Agua de dilución
punto 14
Inóculo
punto 16
Sustrato
punto 17
0
—
0
1,0
100
2
1
—
0,1
0,9
100
2
3,3
—
0,33
0,67
100
2
10
0,1
—
0,9
100
2
33
0,33
—
0,67
100
2
100
1,0
—
0
100
2
Volumen total del frasco = 160 ml. Volumen de líquido = 103 ml.
Volumen de gas = 57 ml, o el 35,6 % del volumen total.
30.
Del mismo modo se purga con gas nitrógeno un número suficiente de frascos de ensayo vacíos para ensayar las eventuales sustancias problema volátiles o líquidas insolubles (véase el punto 27).
Controles y sustancia de referencia
31.
Se preparan conjuntos al menos triplicados de frascos con lodo y sustrato solamente, para actuar de controles. Se preparan frascos replicados adicionales con lodo y sustrato más una cantidad suficiente de solución madre de la sustancia de referencia, 3,5-diclorofenol (punto 21), para obtener una concentración final de 150 mg/l. Esta concentración debe inhibir la producción de gas en alrededor del 50 %. Otra posibilidad es preparar un intervalo de concentraciones de la sustancia de referencia. Además, se preparan cuatro frascos adicionales para la medición del pH, con lodo, agua desoxigenada y sustrato. Se añade la sustancia problema a dos frascos a la concentración más alta ensayada y se añade agua desoxigenada a los otros dos frascos.
32.
Ha de velarse por que todos los frascos (sustancias problema y de referencia, y controles) contengan el mismo volumen de líquido (VR); en caso necesario, se añade agua desionizada desoxigenada (punto 14) para completar el volumen. El espacio libre debe constituir entre el 10 % y el 40 % del volumen de los frascos, seleccionándose el valor real a partir de los datos obtenidos en el ensayo preliminar. Después de añadir a los frascos todos los componentes, se retira la aguja que suministra el gas y se cierra cada frasco con tapón de caucho y cápsula de aluminio [punto 12, letra b)], humedeciendo el tapón con una gota de agua desionizada para ayudar a su inserción. Se mezcla el contenido de cada frasco por agitación.
Incubación de los frascos
33.
Se transfieren los frascos al incubador de temperatura controlada, provisto preferentemente de un dispositivo de agitación, y se mantienen a 35 °C ± 2 °C. Los frascos se incuban en la oscuridad. Después de aproximadamente 1 hora, se iguala la presión de los frascos a la atmosférica mediante la inserción de una aguja de jeringa, unida al manómetro [punto 12, letra c)], a través del cierre de cada frasco, uno tras otro; se abre la llave hasta que el manómetro indique presión cero y, por último, se cierra la llave. La aguja debe insertarse a un ángulo de unos 45° para evitar la fuga de gas de los frascos. Si los frascos se incuban sin mecanismo de agitación, hay que agitarlos manualmente dos veces al día durante todo el período de incubación para equilibrar el sistema. Los frascos se incuban en posición invertida para evitar cualquier pérdida de gas a través del tapón. Sin embargo, la inversión no es apropiada en los casos en que quepa la posibilidad de que las sustancias problema insolubles se adhieran al fondo del frasco.
Medida de la presión
34.
Cuando los frascos hayan alcanzado la temperatura de 35 °C ± 2 °C, se mide y registra el pH del contenido de dos de los cuatro frascos preparados al efecto y se desecha este contenido; los frascos restantes siguen incubándose en la oscuridad. Se mide y se registra la presión de los frascos dos veces al día durante el siguiente período de 48 a 72 horas, mediante la inserción de la aguja del manómetro a través del cierre de cada frasco, uno tras otro, secando la aguja después de cada medida. Todas las partes del frasco deben mantenerse a la temperatura de incubación durante la medición, que debe llevarse a cabo lo más deprisa posible. Se registra la lectura de la presión una vez se haya estabilizado. A continuación se abre la llave para ventilar, y se cierra cuando la presión llegue a cero. Se prosigue el ensayo por lo general durante un período de 48 horas desde el momento de la primera igualación de la presión, designado “tiempo 0”. El número de lecturas y de ventilaciones debe limitarse en el caso de las sustancias volátiles a uno (al final de la incubación) o dos para reducir al mínimo las pérdidas de sustancia problema (10).
35.
Si la lectura de la presión es negativa, no se debe abrir la llave. A veces se acumula la humedad en la aguja de jeringa y en los tubos, lo que se pone de manifiesto por la lectura de una pequeña presión negativa. En tal caso, se extrae la aguja, se agitan los tubos, se secan con un paño y se pone una nueva aguja.
Medición del pH
36.
Se mide y se registra el pH del contenido de cada frasco, después de la última medida de la presión.
DATOS E INFORME
Expresión de los resultados
37.
Se calculan la suma y la media de las presiones registradas en cada intervalo de tiempo para cada serie de frascos replicados y se calcula la media de la presión de gas global acumulada en cada intervalo de tiempo para cada serie de réplicas. Se trazan las curvas de la media de la producción de gas acumulada (Pa) frente al tiempo, correspondientes a los frascos de control, de ensayo y de referencia. Se selecciona un tiempo de la parte lineal de la curva, normalmente 48 horas, y se calcula el porcentaje de inhibición (I) para cada concentración a partir de la ecuación [1]:
I = (1 – Pt/PC) × 100
[1],
donde
I
=
porcentaje de inhibición, en %;
Pt
=
presión del gas producido con el material de ensayo al tiempo seleccionado, en pascales (Pa);
Pc
=
presión del gas producido en el control al mismo tiempo, en pascales (Pa).
Es aconsejable trazar ambas gráficas, es decir, la gráfica de I frente a la concentración y también frente al logaritmo de la concentración, de manera que se pueda seleccionar la curva que se aproxime más a la linealidad. Se determina el valor de la EC50 (mg/l) visualmente o por análisis de regresión a partir de esa curva más próxima a la linealidad. A efectos de comparación, puede resultar más útil expresar la concentración de la sustancia en mg/g de sólidos secos totales. Para obtener esta concentración, se divide la concentración volumétrica (mg/l) por la concentración volumétrica de sólidos del lodo seco (g/l) (punto 16).
38.
Se calcula el porcentaje de inhibición obtenido por la concentración única de la sustancia de referencia utilizada o la EC50 si se ha estudiado un número suficiente de concentraciones.
39.
El valor medio de la presión del gas producido en el control Pc (Pa) se convierte en volumen recurriendo a la curva de calibración del manómetro (apéndice 2) y a partir de ese valor se calcula el rendimiento de gas, expresado como volumen producido en 48 horas por 100 ml de lodo sin diluir, a una concentración de sólidos de entre el 2 % (20 g/l) y el 4 % (40 g/l).
Criterios de validez
40.
Los resultados del ensayo interlaboratorios de la ISO (5) ha puesto de manifiesto que la sustancia de referencia (3,5-diclorofenol) causaba una inhibición del 50 % de la producción de gas en un intervalo de concentraciones de 32 mg/l a 510 mg/l, con una media de 153 mg/l (punto 10). Este intervalo es tan amplio que no resulta posible establecer como criterios de validez unos límites precisos de la inhibición; para que sea posible, será necesario que se consiga saber cómo producir inóculos menos variables. El volumen de gas producido en los frascos de control en 48 horas varía entre 21 ml/g de materia seca de lodo y 149 ml/g (media de 72 ml/g). No había ninguna relación evidente entre el volumen de gas producido y el correspondiente valor de EC50. El pH final variaba entre 6,1 y 7,5.
41.
El ensayo se considera válido cuando se obtiene una inhibición de más del 20 % en el control de referencia que contiene 150 mg/l de 3,5-diclorofenol, se producen más de 50 ml de gas por gramo de materia seca en el control en blanco y el valor del pH está comprendido entre 6,2 y 7,5 al final de la prueba.
Informe del ensayo
42.
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:
Sustancia problema
—
nombre común, nombre químico, número CAS, fórmula estructural y propiedades fisicoquímicas pertinentes;
—
pureza (impurezas) de la sustancia problema.
Condiciones del ensayo
—
volumen del contenido líquido y del espacio libre en los recipientes de ensayo;
—
descripción de los recipientes de ensayo y medición del gas (por ejemplo, tipo de manómetro);
—
aplicación de la sustancia problema y de la sustancia de referencia al sistema de ensayo, concentraciones de ensayo utilizadas y empleo eventual de disolventes;
—
datos del inóculo empleado: nombre de la depuradora de aguas residuales, descripción de la fuente de aguas residuales tratadas (por ejemplo, temperatura de funcionamiento, tiempo de retención del lodo, aguas residuales predominantemente domésticas o residuos industriales, etc.), concentración de sólidos, actividad de producción de gas del digestor anaeróbico, exposición previa o posible adaptación anterior a sustancias tóxicas o lugar de recogida de fangos, sedimentos, etc.;
—
temperatura de la incubación e intervalo;
—
número de réplicas.
Resultados
—
valores de pH al final del ensayo;
—
todos los datos medidos obtenidos con los recipientes de ensayo, de control en blanco y de sustancia de referencia, cuando proceda (por ejemplo, presión en Pa o milibares) en forma de cuadro;
—
porcentaje de inhibición en los frascos de ensayo y de referencia, y curvas de inhibición-concentración;
—
cálculo de los valores de EC50, expresada en mg/l y en mg/g;
—
producción de gas por g de lodo en 48 horas;
—
motivos del eventual rechazo de resultados del ensayo;
—
discusión de los resultados, incluidas la eventual desviación de los procedimientos de este método de ensayo y la eventual desviación de los resultados del ensayo respecto a lo que cabría esperar, debido a interferencias y errores;
—
indicación de si el objetivo del ensayo es medir la toxicidad para microorganismos que hayan sufrido o no exposición previa.
BIBLIOGRAFÍA
(1)
Capítulo C.11 del presente anexo. Lodo activado: prueba de inhibición de la respiración.
(2)
Capítulo C.43 del presente anexo. Biodegradabilidad anaeróbica de las sustancias orgánicas en lodo digerido: método de medición de la producción de gases.
(3)
Organización Internacional de Normalización (2003) ISO 13641-1 Water Quality — Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria — Part 1: General Test.
(4)
Organización Internacional de Normalización (2003) ISO 13641-2 Water Quality — Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria — Part 2: Test for low biomass concentrations.
(5)
ISO (2000) Ring test of ISO 13641-1 and ISO 13641-2. Determination of inhibition of activity of anaerobic bacteria. BL 6958/A. Evans MR, Painter HA. Brixham Environmental Laboratory, AstraZeneca UK Ltd., Brixham, TQ5 8BA UK.
(6)
Swanwick JD, Foulkes M (1971). Inhibition of anaerobic digestion of sewage sludge by chlorinated hydrocarbons. Wat. Pollut. Control, 70, 58-70.
(7)
HMSO (1986) Determination of the inhibitory effects of chemicals and waste waters on the anaerobic digestion of sewage sludge. ISBN 0 117519 43 X, En: Methods for the Examination of Waters and Associated Materials UK.
(8)
Shelton DR, Tiedje JM (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. Appl. Env. Microbiol. 47 850-857.
(9)
Battersby NS and Wilson V (1988). Evaluation of a serum bottle technique for assessing the anaerobic biodegradability of organic compounds under methanogenic conditions. Chemosphere 17, 2441-2460.
(10)
Wilson V, Painter HA and Battersby NS (1992). A screening method for assessing the inhibition of the anaerobic gas production from sewage sludge. Proc. Int. Symp. on Ecotoxicology. Ecotoxicological Relevance of Test Methods, GSF Forschungzentrum, Neuherberg, Alemania (1990). Eds. Steinberg C y Kettrup A, pp. 117-132 (1992).
(11)
Kawahara K, Yakabe Y, Chida T, and Kida K (1999). Evaluation of laboratory-made sludge for an anaerobic biodegradability test and its use for assessment of 13 chemicals. Chemosphere, 39 (12), 2007-2018.
(12)
Organización Internacional de Normalización (1995) ISO 10634. Calidad del agua. Líneas directrices para la preparación y tratamiento de los compuestos orgánicos poco solubles en agua para la subsecuente evaluación de su biodegradabilidad en medio acuoso.
(13)
Organización Internacional de Normalización, ISO 11923 (1997) Calidad del agua. Determinación de los sólidos en suspensión. Método de filtración por filtro de fibra de vidrio..
Apéndice 1
Ejemplo de aparato para medir la producción de biogás mediante la presión del gas Image
Leyenda:
1
—
Manómetro
2
—
Llave de tres vías estanca al gas
3
—
Aguja de jeringa
4
—
Cierre estanco a los gases (cápsula y tapón)
5
—
Espacio libre
6
—
Inóculo de lodo digerido
Recipiente de ensayo mantenido en un ambiente a 35 °C ± 2 °C
Apéndice 2
Conversión DE las lecturas del manómetro
Las lecturas del manómetro pueden relacionarse con los volúmenes de gas por medio de una curva patrón y a partir de esta se puede calcular el volumen de gas producido por g de lodo seco en 48 horas. Este índice de actividad se utiliza como uno de los criterios con los que se evalúa la validez de los resultados del ensayo. La curva de calibración se obtiene inyectando volúmenes conocidos de gas a 35 °C ± 2 °C en frascos de suero que contienen un volumen de agua igual al de la mezcla de reacción, VR.
—
Poner en cinco frascos de suero alícuotas de VR ml de agua, mantenida a 35 °C ± 2 °C. Cerrar los frascos y ponerlos en baño de agua a 35 °C ± 2 °C durante 1 hora para equilibrarlos;
—
Conectar el manómetro, dejar que se estabilice y ajustar a cero;
—
Introducir la aguja de jeringa a través del cierre de uno de los frascos, abrir la llave hasta que la lectura del manómetro sea cero y cerrar la llave a continuación;
—
Repetir el mismo procedimiento con los demás frascos;
—
Inyectar en cada frasco 1 ml de aire a 35 °C ± 2 °C. Insertar la aguja (unida al manómetro) a través del cierre de uno de los frascos y dejar que se estabilice la lectura de la presión. Registrar la presión, abrir la llave hasta que la lectura de la presión sea cero y, a continuación, cerrar la llave;
—
Repetir el mismo procedimiento con los demás frascos;
—
Repetir todo el proceso con 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml y 50 ml de aire;
—
Trazar una curva de conversión de la presión (Pa) frente al volumen de gas inyectado (ml). La respuesta del instrumento es lineal a lo largo del intervalo de 0 Pa a 70 000 Pa, y de 0 ml a 50 ml de producción de gas.
Apéndice 3
Factores identificados que pueden dar lugar a resultados falsos
a) Calidad de los cierres
Se encuentran en el comercio distintos tipos de tapones para los frascos de suero; muchos de ellos, que contienen caucho butílico, pierden su estanqueidad cuando se perforan con una aguja en las condiciones del ensayo. A veces la presión cae muy lentamente una vez que se ha perforado el tapón con la aguja de jeringa. Se recomienda el uso de tapones estancos al gas para evitar las fugas [punto 12, letra b)].
b) Humedad en la aguja de jeringa
A veces se acumula la humedad en la aguja de jeringa y en los tubos, lo que se pone de manifiesto por la lectura de una pequeña presión negativa. Para corregir esto, se retira la aguja, se agitan los tubos, se secan con un paño y se pone una nueva aguja [puntos 12, letra c), y 35].
c) Contaminación con oxígeno
Los métodos anaeróbicos están expuestos a error debido a la contaminación con oxígeno, lo que puede provocar una producción de gas más baja. En este método, dicha posibilidad debe reducirse al mínimo mediante la utilización de técnicas estrictamente anaeróbicas, incluido el uso de la caja de guantes.
d) Sustratos gruesos en el lodo
La producción anaeróbica de gas y la sensibilidad del lodo se ven influidas por los sustratos que se transfieren con el inóculo a los frascos de ensayo. El lodo digerido de digestores anaeróbicos domésticos suele contener todavía materia reconocible, como pelo y residuos vegetales de celulosa, lo que tiende a hacer difícil la toma de muestras representativas. La materia insoluble gruesa puede retirarse tamizando el lodo, lo que facilita la toma de muestras representativas (punto 16).
e) Sustancias problema volátiles
Las sustancias problema volátiles se liberarán al espacio libre de los frascos de ensayo. Esto puede dar lugar a la pérdida de una parte del material de ensayo por el sistema durante la evacuación tras las mediciones de la presión, lo que puede dar unos valores demasiado elevados de la EC50. El error puede reducirse mediante una adecuada elección de la proporción entre el volumen del espacio libre y el del líquido y evitando la evacuación tras las mediciones de la presión (10).
f) Producción de gas no lineal
Si la gráfica de la producción acumulada media de gas frente al tiempo de incubación no es aproximadamente lineal a lo largo del período de 48 h, la exactitud del ensayo puede verse reducida. A fin de superar este problema, puede ser aconsejable utilizar lodo de digestión procedente de una fuente distinta y/o añadir una concentración aumentada de la sustancia problema, de caldo nutritivo, de extracto de levadura y de glucosa (punto 29).
Apéndice 4
Aplicación a muestras ambientales con baja concentración de biomasa: fangos, sedimentos, etc., de carácter anaeróbico
INTRODUCCIÓN
A.1. En general, la actividad microbiana específica (volumen de gas producido por g de sólidos secos) de fangos, sedimentos o suelos anaeróbicos de origen natural es mucho más baja que la de los lodos anaeróbicos procedentes de aguas residuales. Por ello, cuando se trata de medir los efectos inhibidores de las sustancias sobre estas muestras menos activas, es necesario modificar algunas de las condiciones experimentales. Con estas muestras menos activas se dispone en general de dos posibilidades:
a)
proceder a un ensayo preliminar modificado (punto 25) con la muestra de fango, suelo, etc., sin diluir a 35 °C ± 2 °C o a la temperatura del lugar de recogida de la muestra, para conseguir una simulación más exacta (como en la parte 1 de ISO 13641);
b)
o efectuar el ensayo con un lodo de digestión diluido (1 en 100) para simular la baja actividad que se espera de la muestra ambiental, pero manteniendo la temperatura a 35 °C ± 2 °C (como en la parte 2 de ISO 13641).
A.2. La opción a) puede conseguirse siguiendo el método descrito aquí (equivalente a la parte 1 de la norma ISO 13641), pero es esencial efectuar un ensayo preliminar (punto 25) para determinar las condiciones óptimas, salvo que estas ya se conozcan por ensayos anteriores. La muestra de fango o de sedimento debe homogeneizarse completamente, por ejemplo en un mezclador, y, en caso necesario, diluirse con una pequeña proporción de agua desgasificada de dilución (punto 14), de modo que sea lo suficientemente fluida como para poder transferirse mediante una pipeta de punta ancha o una probeta. En caso de que se considere que pueden ser insuficientes los nutrientes, la muestra de fango puede centrifugarse (en condiciones anaeróbicas) y volver a suspenderse en un medio mineral que contenga extracto de levadura (A.11)
A.3. Opción b): Este planteamiento imita razonablemente bien la baja actividad de las muestras ambientales, pero carece de la alta concentración de sólidos en suspensión presentes en estas muestras. No se conoce el papel de estos sólidos en la inhibición, pero es posible que la reacción entre las sustancias problema y los componentes del fango, junto con la adsorción de las sustancias problema en los sólidos, den lugar a una disminución de la toxicidad de la sustancia problema.
A.4. La temperatura es otro factor importante: para conseguir una simulación estricta, los ensayos deben realizarse a la temperatura del lugar de la muestra, ya que se sabe que hay distintos grupos de bacterias productoras de metano que funcionan a distintos intervalos de temperatura, a saber, los termófilos (~ 30 – 35 °C), los mesófilos (20 – 25 °C) y los psicrófilos (< 20 °C), y que pueden mostrar diferentes pautas de inhibición.
A.5. Duración. En el ensayo general (parte 1), utilizando lodos sin diluir, la producción de gas en los 2-4 días siempre ha sido suficiente, mientras que en la parte 2, con lodos diluidos a la centésima, se produce en ese plazo una cantidad insuficiente o nula de gas en el ensayo interlaboratorios. Madsen et al. (1996), en la descripción de este último ensayo, dicen que debe durar al menos 7 días.
Ensayos efectuados con bajas concentraciones de biomasa (opción b)
Deben introducirse los siguientes cambios y modificaciones, que se añaden a algunos de los actuales puntos y subpuntos del texto principal, o los sustituyen.
A.6. En el punto 6 se añade el texto siguiente: Principio del ensayo:
“Esta técnica puede utilizarse con lodo anaerobio diluido a la centésima, en parte para simular la baja actividad de fangos y sedimentos. La temperatura de incubación puede ser de 35 °C o bien la del lugar del que se haya tomado la muestra. Dado que la actividad bacteriana es mucho menor que en el caso del lodo sin diluir, el período de incubación debe ampliarse a 7 días como mínimo.”.
A.7. En el punto 12, letra a), se añade el texto siguiente:
“el incubador debe ser capaz de funcionar a temperaturas tan bajas como 15 °C.”.
A.8. Se añade un reactivo más tras el punto 13:
“Ácido fosfórico (H3PO4), 85 % en masa en agua.”.
A.9. Se añade el siguiente texto al final del punto 16:
“Se utiliza en el ensayo una concentración final de 0,20 ± 0,05 g/l de sólidos secos totales.”.
A.10. Punto 17. Sustrato de ensayo
No se emplea este sustrato, sino que se sustituye por extracto de levadura (véanse los puntos 17; A. 11, A. 12, A. 13).
A.11. Se requiere la presencia de un medio mineral, con oligoelementos, para diluir el lodo anaerobio y, por motivos prácticos, se añade a este medio el sustrato orgánico, extracto de levadura.
Tras el punto 17 se añade el texto siguiente:
“a)
Medio mineral de ensayo, con extracto de levadura.
Se prepara a partir de un medio de ensayo concentrado 10 veces [punto 17, letra b); A.12] con una solución de oligoelementos [punto 17, letra c); A. 13]. Utilícese sulfuro de sodio nonahidratado recién suministrado [punto 17, letra b); A. 12] o lávese y séquese antes de su utilización a fin de asegurarse de que dispone de suficiente capacidad reductora. Si el ensayo se lleva a cabo sin utilizar una caja de guantes [punto 12, letra j)], será necesario aumentar la concentración de sulfuro de sodio en la solución madre a 2 g/l (desde 1 g/l). También es posible añadir sulfuro de sodio de una solución madre adecuada a través del tapón de los frascos de ensayo cerrados, ya que este proceso reduce el riesgo de oxidación, hasta obtener una concentración final de 0,2 g/l. Otra posibilidad es utilizar citrato de titanio (III) [punto 17, letra b)]. Se añade a través del tapón de los frascos de ensayo cerrados hasta obtener una concentración de entre 0,8 mmol/l y 1,0 mmol/l. El citrato de titanio (III) es un agente reductor muy eficaz y de baja toxicidad, que se prepara de la forma siguiente: Se disuelven 2,94 g de citrato de trisodio dihidratado en 50 ml de agua de dilución exenta de oxígeno (punto 14) (lo que se traduce en una solución de 200 mmol/l) y se añaden 5 ml de una solución de cloruro de titanio (III) (15 g/100 ml de agua de dilución). Se neutraliza el pH a 7 ± 0,5 con carbonato de sodio y se introduce en un frasco de suero apropiado bajo una corriente de gas nitrógeno. La concentración de citrato de titanio (III) en esta solución madre es igual a 164 mmol/l. El medio de ensayo debe utilizarse inmediatamente o conservarse a 4 °C durante un máximo de un día.
A.12.
b)
Medio de ensayo concentrado diez veces, elaborado con los siguientes componentes:
dihidrogenofosfato de potasio anhidro (KH2PO4)
2,7 g
hidrogenofosfato de disodio (Na2HPO4)
4,4 g
(u 11,2 g de dodecahidrato)
cloruro de amonio (NH4Cl)
5,3 g
cloruro de calcio dihidratado (CaC12 · 2H2O)
0,75 g
cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2 · 6H2O)
1,0 g
cloruro de hierro (II) tetrahidratado (FeCl2 · 4H2O)
0,2 g
resazurina (indicador redox)
0,01 g
sulfuro de sodio nonahidratado (Na2S · 9H2O)
1,0 g
(o citrato de titanio (III)) concentración final
0,8 mmol/l a 1,0 mmol/l
solución de oligoelementos [véase punto 17, letra c); A.13]
10,0 ml
extracto de levadura
100 g
disolver en agua de dilución (punto 14) y enrasar a:
1 000 ml
A.13.
c)
Solución de oligoelementos, preparada con los componentes siguientes:
cloruro de manganeso (II) tetrahidratado (MnCl2 · 4H2O)
0,5 g
ácido orto-bórico (H3BO3)
0,05 g
cloruro de zinc (ZnCl2)
0,05 g
cloruro de cobre (II) (CuCl2)
0,03 g
molibdato de sodio dihidratado (Na2MoO4 · 2H2O)
0,01 g
cloruro de cobalto (II) hexahidratado (CoCl2 · 6H2O)
1,0 g
cloruro de níquel (II) hexahidratado (NiCl2 · 6H2O)
0,1 g
selenito de disodio (Na2SeO3)
0,05 g
disolver en agua de dilución (punto 14) y enrasar a:
1 000 ml”.
A.14. Punto 25: Ensayo preliminar
Es fundamental efectuar un ensayo preliminar como se describe en el punto 24, con la diferencia de que la concentración de sólidos del lodo debe ser una centésima de las concentraciones indicadas, es decir, 0,1 g/l, 0,2 g/l y 0,4 g/l. La duración de la incubación debe ser como mínimo de 7 días.
Nota: En el ensayo interlaboratorios (5) el volumen del espacio libre era demasiado alto, con el 75 % del volumen total; debe estar en el intervalo recomendado de entre el 10 % y el 40 %. El criterio pertinente es que el volumen de gas producido en torno al 80 % de inhibición se pueda medir con una precisión aceptable (por ejemplo, de ± 5 % a ± 10 %).
A.15. Puntos 26 a 30: Adición de sustancia problema, inóculo y sustrato
La adición se hace de la misma forma que se describe en estos puntos, pero la solución de sustrato (punto 17) se sustituye por el medio de ensayo más sustrato de extracto de levadura (A.11).
Además, la concentración final de sólidos del lodo seco se reduce de 2 g/l — 4 g/l a 0,2 ± 0,05 g/l (A.9). En el cuadro A.1, que sustituye al cuadro que figura en el punto 29, se indican dos ejemplos de la adición de componentes a la mezcla de ensayo.
A.16. Punto 33: Incubación de los frascos
A causa de la disminución prevista de la velocidad de producción de gas, la incubación se lleva a cabo durante al menos 7 días.
A.17. Punto 34: Medidas de la presión
Para medir la presión en el espacio libre de los frascos se utiliza el mismo procedimiento que se describe en el punto 34 si hay que conocer las cantidades presentes en la fase gaseosa. Si van a medirse las cantidades totales de CO2 y de CH4, hay que reducir el pH de la fase líquida a alrededor de 2 mediante la inyección de H3PO4 a cada frasco pertinente y se mide la presión tras 30 minutos de agitación a la temperatura de ensayo. Sin embargo, puede obtenerse más información sobre la calidad del inóculo midiendo la presión en cada frasco antes y después de la acidificación. Por ejemplo, cuando la velocidad de producción de CO2 es mucho más elevada que la de metano, la sensibilidad de las bacterias fermentadoras puede verse alterada o las bacterias metanógenas pueden verse afectadas preferentemente por la sustancia problema.
A.18. Punto 36: Medición del pH
Si se utiliza H3PO4, han de prepararse especialmente para la medición del pH varios frascos más a los que no se habrá añadido ningún H3PO4.
BIBLIOGRAFÍA:
Madsen, T, Rasmussen, HB; and Nilsson, L (1996), Methods for screening anaerobic biodegradability and toxicity of organic chemicals. Project No.336, Water Quality Institute, Danish Environment Protection Agency, Copenhague.
Cuadro A.1.
Ejemplos de organización del ensayo respecto a los lotes de ensayo
Componentes de la mezcla de reacción
Ejemplo 1
Ejemplo 2
Orden normal de adición
Concentración en el inóculo preparado (gl/l)
0,42
2,1
—
Volumen de inóculo añadido (ml)
45
9
4
Concentración de inóculo en los frascos de ensayo (g/l)
0,20
0,20
—
Volumen de medio de ensayo añadido (ml)
9
9
2
Volumen de agua de dilución añadida (ml)
36
72
3
Concentración de extracto de levadura en los frascos de ensayo (g/l)
9,7
9,7
—
Volumen de solución madre de sustancia problema (ml)
3
3
1
Volumen total de líquido (ml)
93
93
—
Apéndice 5
Definiciones
A efectos del presente método de ensayo, se aplicarán las siguientes definiciones:
Sustancia : sustancia o mezcla.
Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.
C.35. PRUEBA DE TOXICIDAD PARA LUMBRICULUS EN SEDIMENTOS Y AGUA CON SEDIMENTO ENRIQUECIDO
INTRODUCCIÓN
1.
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 225 (2007). Los animales endobentónicos que ingieren sedimentos pueden estar muy expuestos a las sustancias ligadas a los sedimentos, por lo que merecen especial atención; véanse, por ejemplo, las referencias (1), (2), (3). Entre estos animales que ingieren sedimentos, los oligoquetos acuáticos desempeñan un importante papel en los sedimentos de los sistemas acuáticos. Por la bioturbación del sedimento y por servir de presa, estos animales pueden influir mucho en la biodisponibilidad de tales sustancias para otros organismos, como, por ejemplo, los peces bentívoros. En contraste con los organismos epibentónicos, los oligoquetos acuáticos endobentónicos (por ejemplo, Lumbriculus variegatus) se entierran en el sedimento e ingieren partículas de sedimento por debajo de la superficie de este. Esto hace que los organismos de ensayo queden expuestos a la sustancia problema a través de todas las posibles vías de absorción, como, por ejemplo, contacto con partículas de sedimento contaminadas, o ingestión de tales partículas, pero también a través del agua intersticial y del agua sobrenadante).
2.
El presente método de ensayo está diseñado para evaluar los efectos de la exposición prolongada del oligoqueto endobentónico Lumbriculus variegatus (Müller) a las sustancias asociadas a los sedimentos. Se basa en los actuales protocolos de ensayo de toxicidad y de bioacumulación del sedimento; véanse por ejemplo las referencias (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10). La descripción del método se refiere a condiciones de ensayo estáticas. La situación de exposición aplicada en el presente método de ensayo es el enriquecimiento del sedimento con la sustancia problema. El objetivo de enriquecer el sedimento consiste en simular un sedimento contaminado con la sustancia problema.
3.
Las sustancias que tienen que someterse a ensayo respecto a organismos que viven en los sedimentos suelen permanecer en este compartimento durante largos plazos. Los organismos que viven en los sedimentos pueden sufrir exposición a través de varias vías. La importancia relativa de cada vía de exposición y el tiempo que tarda cada una de ellas en contribuir a los efectos tóxicos generales dependen de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia correspondiente y de su destino final en el animal. En el caso de las sustancias que se adsorben fuertemente (por ejemplo, con log Kow > 5) o en el de las sustancias que se unen covalentemente con el sedimento, la ingestión de alimentos contaminados puede constituir una vía de exposición significativa. A fin de no subestimar la toxicidad de tales sustancias, los alimentos necesarios para el crecimiento y la reproducción de los organismos de ensayo se añaden al sedimento antes de aplicar la sustancia problema (11). El método de ensayo que se describe es lo suficientemente detallado para que pueda efectuarse el ensayo, sin perjuicio de posibles adaptaciones del diseño experimental en función de las condiciones específicas de cada laboratorio y de las diversas características de las sustancias problema.
4.
El método de ensayo tiene por objeto determinar los efectos de la sustancia problema sobre la reproducción y la biomasa de los organismos de ensayo. Los parámetros biológicos medidos son el número total de gusanos supervivientes y la biomasa (peso seco) al final de la exposición. Estos datos se analizan bien aplicando un modelo de regresión para estimar la concentración que causaría un efecto del x % (p. ej., EC50, EC25, y EC10), o bien realizando contrastes estadísticos de hipótesis para determinar la concentración sin efecto observado (NOEC) y la concentración mínima con efecto observado (LOEC).
5.
En el capítulo C.27 del presente anexo, “Ensayo de toxicidad para quironómidos en sistemas sedimento-agua con sedimento enriquecido” (6), se aportan muchos datos fundamentales y útiles para la realización del presente método de ensayo de toxicidad en los sedimentos. Por lo tanto, dicho documento ha servido de base sobre la cual se han aportado las modificaciones necesarias para la realización de ensayos de toxicidad en los sedimentos con Lumbriculus variegatus. Otros documentos a los que se hace referencia son, por ejemplo, la Standard Guide for Determination of the Bioaccumulation of Sediment-Associated Contaminants by Benthic Invertebrates de la ASTM (3), los Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates de la U.S. EPA (7), y la Standard Guide for Collection, Storage, Characterization, and Manipulation of Sediments for Toxicological Testing and for selection of samplers used to collect benthic invertebrates de la ASTM (12). Además, la experiencia práctica obtenida durante el ensayo interlaboratorios del método de ensayo [ (13), informe del ensayo interlaboratorios] y los datos de la bibliografía han sido importantes fuentes de información para elaborar el presente documento.
CONDICIONES PREVIAS E INFORMACIÓN ORIENTATIVA
6.
Antes de empezar el estudio ha de obtenerse información sobre la sustancia problema, como las precauciones de seguridad, las condiciones adecuadas de conservación y los métodos analíticos. En la referencia 14 se ofrecen orientaciones sobre los ensayos de sustancias con propiedades fisicoquímicas que dificultan la realización del ensayo.
7.
Antes de llevar a cabo el ensayo, debe conocerse la siguiente información acerca de la sustancia problema:
—
nombre común, nombre químico (de preferencia la denominación IUPAC), fórmula estructural, número de registro CAS, pureza;
—
presión de vapor;
—
hidrosolubilidad.
8.
La siguiente información adicional se considera útil antes de empezar el ensayo:
—
coeficiente de reparto octanol/agua Kow;
—
coeficiente de reparto carbono orgánico-agua, expresado como Koc;
—
hidrólisis;
—
fototransformación en el agua;
—
biodegradabilidad;
—
tensión superficial.
9.
Antes del inicio del ensayo debe conseguirse información sobre determinadas características de los sedimentos que se vayan a utilizar (7). En los puntos 22 a 25 se encuentran más detalles al respecto.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
10.
Se exponen gusanos de estado fisiológico similar (sincronizadas como se describe en el apéndice 5) a una serie de concentraciones de la sustancia tóxica aplicada a la fase sedimentaria de un sistema sedimento-agua. Deben utilizarse como medio sedimentos artificiales y agua reconstituida. Los recipientes de ensayo sin adición de la sustancia problema sirven de controles. La sustancia problema se introduce en el sedimento en bruto para cada nivel de concentración, con el fin de minimizar la variabilidad entre las réplicas de cada nivel de concentración, y los organismos de ensayo se introducen posteriormente en los recipientes de ensayo en los que las concentraciones de sedimento y agua se habrán equilibrado (véase el punto 29). Los animales de ensayo se exponen a los sistemas sedimento-agua durante un período de 28 días. Teniendo en cuenta el bajo contenido de nutrientes en el sedimento artificial, este debe enriquecerse con una fuente de alimentos (véanse los puntos 22 a 23, y el apéndice 4) para velar por que los gusanos crezcan y se reproduzcan en condiciones controladas. De esta manera se garantiza que los animales de ensayo se exponen a través del agua y del sedimento, así como de sus alimentos.
11.
El parámetro preferido para este tipo de estudio es la ECx (p. ej., EC50, EC25, y EC10; concentración con efecto que afecta al x % de los organismos de ensayo) para la reproducción o la biomasa, comparando con el control. No obstante, ha de observarse que, considerando la elevada incertidumbre de las ECx bajas (p. ej., EC10, EC25) con unos límites de confianza del 95 % extremadamente elevados (véase, p. ej., la referencia 15) y la potencia estadística calculada durante el contraste de hipótesis, se acepta que la EC50 es el parámetro más sólido. Por otra parte, la concentración sin efecto observado (NOEC) y la concentración mínima con efecto observado (LOEC) pueden calcularse en relación con la biomasa y con la reproducción, si el diseño del ensayo y los datos permiten estos cálculos (véanse los puntos 34 a 38). El objetivo del estudio, la determinación de CEx o de la NOEC, determinará el diseño del ensayo.
ENSAYOS DE REFERENCIA
12.
Se espera que el comportamiento de los organismos de control demuestre suficientemente la capacidad de un laboratorio para realizar el ensayo y, si se dispone de datos históricos, la repetibilidad del ensayo. Además, pueden llevarse a cabo ensayos de toxicidad de referencia a intervalos regulares con un tóxico de referencia para evaluar la sensibilidad de los organismos de ensayo. Mediante ensayos de toxicidad de referencia de 96 h en el agua se pueden demostrar satisfactoriamente la sensibilidad y el estado de los animales de ensayo (4) (7). En el apéndice 6 y en el informe sobre el ensayo interlaboratorios del método de ensayo (13) se incluye información sobre la toxicidad del pentaclorofenol (PCP) en ensayos completos (28 días de exposición al sedimento enriquecido). La toxicidad aguda, solo en el agua, del PCP se describe, por ejemplo, en la referencia 16. Esta información puede utilizarse para comparar la sensibilidad del organismo de ensayo en ensayos de referencia con PCP como tóxico de referencia. Se ha recomendado utilizar como tóxico de referencia con L. variegatus el cloruro de potasio (KCl) o el sulfato de cobre (CuSO4) (4) (7). Hasta la fecha, el establecimiento de criterios de calidad basados en los datos de toxicidad de KCl resulta difícil debido a la falta de datos bibliográficos con L. variegatus. En los puntos (17) a (21) se encuentra información sobre la toxicidad del cobre para L. variegatus.
VALIDEZ DEL ENSAYO
13.
Para que un ensayo sea válido, debe cumplir los siguientes criterios:
—
Un ensayo interlaboratorios (13) ha puesto de manifiesto que, en el caso de Lumbriculus variegatus, el número medio de gusanos vivos por réplica en los controles debe haberse multiplicado por un factor de al menos 1,8 al final de la exposición en comparación con el número de gusanos por réplica al inicio de la exposición.
—
El pH del agua sobrenadante debe estar entre 6 y 9 a lo largo de todo el ensayo.
—
La concentración de oxígeno en el agua sobrenadante no debe estar por debajo del 30 % del valor de saturación de aire a la temperatura de ensayo durante el ensayo.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO
Sistema de ensayo
14.
Se recomiendan los sistemas estáticos, sin renovación del agua sobrenadante. Si la proporción entre sedimento y agua (véase el punto 15) es la correcta, una aireación suave será suficiente en principio para mantener la calidad del agua en unos niveles aceptables para los organismos de ensayo (por ejemplo, maximizar los niveles de oxígeno disuelto, minimizar la acumulación de los productos de excreción). Solo en casos excepcionales deben utilizarse sistemas semiestáticos o dinámicos, con renovación intermitente o continua del agua sobrenadante, ya que se supone que la renovación regular del agua sobrenadante afecta al equilibrio químico (por ejemplo, con pérdidas de la sustancia problema del sistema de ensayo).
Recipientes y equipo del ensayo
15.
La exposición debe llevarse a cabo en vasos de precipitados de, por ejemplo, 250 ml de capacidad y 6 cm de diámetro. Pueden utilizarse otros recipientes de vidrio adecuados que garanticen una altura adecuada de sedimento y de agua sobrenadante. Cada recipiente debe recibir una capa de aproximadamente 1,5-3 cm del sedimento artificial. La proporción de la altura de la capa de sedimento respecto a la altura del agua sobrenadante debe ser de 1:4. Los recipientes deben ser de capacidad adecuada para la tasa de carga, es decir, para el número de gusanos de ensayo añadido por unidad de peso del sedimento (véase también el punto 39).
16.
Los recipientes de ensayo y demás equipo que hayan de entrar en contacto con la sustancia problema serán íntegramente de vidrio o de otro material químicamente inerte. Se tendrá cuidado de no utilizar, con ninguna parte del equipo, materiales que puedan disolver o adsorber la sustancia problema o lixiviar otras sustancias y tener algún efecto adverso sobre los animales de ensayo. En todos los equipos en contacto con los medios de ensayo debe utilizarse politetrafluoroetileno (PTFE), acero inoxidable o vidrio. En el caso de sustancias orgánicas de las que se sepa que se adsorben al vidrio, puede ser necesario utilizar vidrio silanizado. Será necesario, en estos casos, deshacerse de los equipos una vez usados.
Especie de ensayo
17.
La especie de ensayo utilizada en este tipo de estudios es el oligoqueto de agua dulce Lumbriculus variegatus (Müller). Esta especie es tolerante a una amplia gama de tipos de sedimentos, y es ampliamente utilizada en los ensayos de toxicidad y de bioacumulación en el sedimento [por ejemplo, (3) (5) (7) (9) (13) (15) (16) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35)]. Deben indicarse el origen de los animales de ensayo, la confirmación de la identidad de la especie [p. ej., (36)], así como las condiciones de cultivo. No es necesario identificar la especie antes de realizar cada ensayo si los organismos proceden de un cultivo del propio laboratorio.
Cultivo de los organismos de ensayo
18.
Con el fin de disponer de un número suficiente de gusanos para la realización de los ensayos de toxicidad en los sedimentos, es útil mantener los gusanos en un cultivo de laboratorio permanente. En el apéndice 5 se encuentran orientaciones sobre los métodos de cultivo en laboratorio de Lumbriculus variegatus, así como fuentes de cultivos de inicio. Para más detalles sobre el cultivo de esta especie, véanse las referencias (3), (7), (27).
19.
Para garantizar que los ensayos se realizan con animales de la misma especie, es muy recomendable el establecimiento de cultivos de una única especie. Ha de velarse por que los cultivos y especialmente los gusanos utilizados en los ensayos no presenten enfermedades ni anomalías observables.
Agua
20.
Se recomienda utilizar como agua sobrenadante en las pruebas agua reconstituida con arreglo al capítulo C.1 del presente anexo (37); esta también podrá utilizarse para los cultivos de laboratorio de los gusanos (para la preparación, véase el apéndice 2). En caso necesario, podrá utilizarse agua natural. El agua seleccionada debe ser tal que permita el crecimiento y la reproducción de la especie de ensayo durante los períodos de aclimatación y de ensayo, sin que se observen comportamientos ni aspectos anormales. Se ha demostrado que Lumbriculus variegatus sobrevive, crece y se reproduce en este tipo de agua (30), que aporta una normalización máxima de las condiciones de ensayo y de cultivo. Si se utiliza agua reconstituida, debe indicarse su composición y el agua debe caracterizarse antes de usarse, al menos por su pH, contenido de oxígeno y dureza (expresada en mg de CaCO3/l). Puede aportar información útil el análisis del agua antes de usarla, para detectar en ella la presencia de microcontaminantes; véase, por ejemplo, el apéndice 3.
21.
El pH del agua sobrenadante debe estar en la banda de 6,0 a 9,0 (véase el punto 13). Si se espera una mayor producción de amoníaco, se considera útil mantener el pH entre 6,0 y 8,0. Para el ensayo de, por ejemplo, ácidos orgánicos débiles, es conveniente ajustar el pH amortiguando el agua utilizada en el ensayo, según lo descrito, por ejemplo, en la referencia (16). La dureza total del agua utilizada en el ensayo debe estar entre 90 y 300 mg CaCO3 por litro en el caso del agua natural. El apéndice 3 resume los criterios adicionales para que el agua de dilución sea aceptable con arreglo a las directrices no 210 de la OCDE (38).
Sedimento
22.
Dado que es posible que no se disponga a lo largo de todo el año de sedimentos naturales no contaminados procedentes de una fuente particular, y que la presencia de organismos endógenos y de microcontaminantes pueda influir en el ensayo, resulta preferible utilizar sedimento artificial (también denominado formulado, reconstituido o sintético). El uso de un sedimento artificial reduce al mínimo la variabilidad de las condiciones de ensayo, así como la introducción de fauna endógena. El siguiente sedimento artificial se basa en el sedimento artificial según (6), (39) y (40). Se recomienda utilizarlo en este tipo de ensayo [ (6), (10), (30), (41), (42), (43)]:
a)
4-5 % de turba esfágnea (peso seco); es importante utilizar turba en forma de polvo, con un grado medio de descomposición, finamente molida (tamaño de partícula ≤ 0,5 mm) y secada solo al aire;
b)
20 ± 1 % de caolín (peso seco), con un contenido de caolinita preferentemente superior al 30 %;
c)
75-76 % de arena de cuarzo (peso seco) (arena fina, granulometría ≤ 2 mm, pero > 50 % de las partículas con un tamaño en la banda de 50-200 μm);
d)
agua desionizada, 30–50 % del peso seco del sedimento, además de los componentes del sedimento seco;
e)
carbonato de calcio de calidad químicamente pura (CaCO3) añadido para ajustar el pH de la mezcla final del sedimento;
f)
el contenido de carbono orgánico total (COT) de la mezcla final debe ser del 2 % (± 0,5 %) del peso seco del sedimento, ajustado mediante el empleo de cantidades adecuadas de turba y arena, según las letras a) y c);
g)
alimento, por ejemplo hojas en polvo de ortiga (Urtica sp., de conformidad con las normas farmacéuticas, para consumo humano), o una mezcla de hojas en polvo de Urtica sp. con alfacelulosa (1:1), en la proporción del 0,4 - 0,5 % de peso seco del sedimento, además de los componentes del sedimento seco; en el apéndice 4 se ofrecen detalles al respecto.
23.
Debe conocerse el origen de la turba, del caolín, del alimento y de la arena. Además de la letra g), el capítulo C.27 del presente anexo (6) recoge una lista de materias vegetales alternativas que pueden utilizarse como fuente de nutrientes: hojas deshidratadas de morera (Morus alba), trébol blanco (Trifolium repens), espinaca (Spinacia oleracea) o cereales.
24.
La fuente elegida de alimento debe añadirse antes del enriquecimiento del sedimento con la sustancia problema, o durante el mismo. La fuente elegida de alimento debe permitir al menos la reproducción aceptable de los controles. Puede aportar información útil el análisis del sedimento artificial o de sus componentes antes de la utilización para detectar la presencia de microcontaminantes. En el apéndice 4 se describe un ejemplo de preparación del sedimento artificial. Puede aceptarse también la mezcla de componentes secos si se demuestra que, tras la adición de agua sobrenadante, no se produce separación de los componentes del sedimento (por ejemplo, flotación de partículas de turba), y que la turba o el sedimento están suficientemente acondicionados (véanse también el punto 25 y el apéndice 4). El sedimento artificial debe caracterizarse al menos por el origen de los componentes, la granulometría (porcentaje de arena, limo y arcilla), el contenido de carbono orgánico total (COT), el contenido de agua y el pH. La medición del potencial redox es opcional.
25.
En caso necesario, por ejemplo con fines de ensayo específicos, pueden también servir como sedimento para el ensayo o el cultivo sedimentos naturales procedentes de lugares exentos de contaminación (3). Sin embargo, si se utiliza sedimento natural, debe caracterizarse al menos por su origen (lugar de recogida), pH y amoníaco del agua intersticial, contenido de carbono orgánico total (COT) y contenido de nitrógeno, granulometría (porcentaje de arena, limo y arcilla), y contenido porcentual de agua (7), y debe estar exento de toda contaminación y de otros organismos que pudieran competir con los organismos de ensayo o convertirlos en sus presas. La medición del potencial redox y de la capacidad de intercambio catiónico es opcional. También se recomienda que el sedimento natural, antes de enriquecerse con la sustancia problema, se someta durante siete días a las mismas condiciones que vayan a reinar posteriormente en el ensayo. Al final de este período de acondicionamiento, el agua sobrenadante debe retirarse y eliminarse.
26.
El sedimento que vaya a utilizarse debe ser tal que permita la supervivencia y la reproducción de los organismos de control durante el período de exposición, sin que se observen comportamientos ni aspectos anormales. Los gusanos de control deben enterrarse en el sedimento, e ingerir este. La reproducción de los controles debe ajustarse al menos al criterio de validez, tal como se describe en el punto 13. La presencia o ausencia de deyecciones en la superficie del sedimento, que indican que los gusanos ingieren el sedimento, debe registrarse y puede ser útil para la interpretación de los resultados del ensayo con respecto a las vías de exposición. Puede obtenerse información adicional sobre la ingestión de sedimento utilizando métodos descritos en las referencias (24), (25), (44) y (45), que especifican la ingestión de sedimento o la selección de partículas en los organismos de ensayo.
27.
En las referencias (3), (7) y (12) se describen procedimientos de manipulación de los sedimentos naturales antes de su empleo en el laboratorio. En el apéndice 4 se describen la preparación y la conservación del sedimento artificial recomendado para utilizarse en el ensayo de Lumbriculus.
Aplicación de la sustancia problema
28.
La sustancia problema debe introducirse en el sedimento. Como se espera que la mayoría de las sustancias problema tengan escasa hidrosolubilidad, con el fin de preparar la solución madre deben disolverse en un volumen lo más pequeño posible de un disolvente orgánico apropiado (por ejemplo, acetona, n-hexano, ciclohexano). La solución madre debe diluirse con el mismo disolvente para preparar las soluciones problema. Los principales criterios para la selección de un agente solubilizante adecuado deben ser la toxicidad y la volatilidad del disolvente, y la solubilidad de la sustancia problema en el disolvente elegido. Para cada nivel de concentración debe utilizarse el mismo volumen de la solución correspondiente. La sustancia problema debe introducirse en el sedimento en bruto para cada nivel de concentración, con el fin de minimizar la variabilidad de su concentración entre las réplicas. Cada una de las soluciones de ensayo se mezcla a continuación con arena de cuarzo, según se describe en el punto 22 (por ejemplo, 10 g de arena de cuarzo por recipiente de ensayo). Para que toda la arena de cuarzo quede sumergida, se considera suficiente un volumen de 0,20-0,25 ml/g de arena. A continuación debe evaporarse el disolvente hasta sequedad. Para reducir al mínimo las pérdidas de sustancia problema por coevaporación (por ejemplo, dependiendo de la presión de vapor de la sustancia), la arena recubierta debe utilizarse inmediatamente después del secado. La arena seca se mezcla con la cantidad adecuada de sedimento artificial del correspondiente nivel de concentración. La cantidad de arena aportada por la mezcla de sustancia problema y arena tiene que tenerse en cuenta a la hora de preparar el sedimento (es decir, el sedimento debe prepararse entonces con menos arena). La ventaja principal de este procedimiento es que prácticamente no se introduce disolvente en el sedimento (7). Como alternativa, por ejemplo en caso de sedimento de campo, es posible añadir la sustancia problema a una porción secada y finamente molida del sedimento como se describe anteriormente en relación con la arena de cuarzo, o mezclando la sustancia problema en el sedimento húmedo por agitación, con evaporación posterior de los eventuales agentes solubilizantes empleados. Debe velarse por que la sustancia problema añadida al sedimento se distribuya de forma total y homogénea por el sedimento. Si es necesario, pueden analizarse submuestras para confirmar las concentraciones objetivo en el sedimento, y para determinar el grado de homogeneidad. También puede ser útil analizar submuestras de las soluciones de ensayo para confirmar las concentraciones objetivo en el sedimento. Dado que se utiliza un disolvente para depositar la sustancia problema sobre la arena de cuarzo, debe emplearse un control del disolvente, que se preparará con la misma cantidad de disolvente que los sedimentos de ensayo. Deben indicase el método utilizado para añadir la sustancia problema (enriquecimiento) y los motivos para la elección de un procedimiento concreto distinto de lo descrito más arriba. El método de enriquecimiento podrá adaptarse a las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, por ejemplo para evitar pérdidas por volatilización durante la fase de enriquecimiento o de equilibrado. En Environment Canada (1995) se encuentran orientaciones adicionales sobre los procedimientos de enriquecimiento (46).
29.
Una vez que se ha preparado el sedimento enriquecido, que se ha distribuido entre los recipientes de ensayo replicados, y que se ha completado con agua de ensayo, es aconsejable dejar que la sustancia problema se reparta entre el sedimento y la fase acuosa [véanse, p. ej., las referencias (3), (7) y (9)]. Esto debe efectuarse de preferencia en las mismas condiciones de temperatura y aireación utilizadas en el ensayo. El tiempo adecuado para el reparto equilibrado depende de la sustancia y del sedimento, y puede ser del orden de horas o de días, aunque en ciertos casos raros puede llegar a ser de varias semanas (4 o 5 semanas) [véanse, p. ej., las referencias (27) y (47)]. En este ensayo no se espera hasta alcanzar el equilibrio completo, pero se recomienda respetar un período de reparto de 48 horas a 7 días. De esta manera se reducirá al mínimo el tiempo necesario para la degradación de la sustancia problema. En función del objeto del estudio, por ejemplo cuando se van a simular las condiciones ambientales, el sedimento enriquecido podrá equilibrarse o envejecerse durante un plazo más largo.
30.
Al final de este período de equilibrado, hay que tomar muestras al menos del agua sobrenadante y de la masa del sedimento, al menos a la concentración más elevada y a una inferior, para determinar la concentración de la sustancia problema. Estas determinaciones analíticas de la sustancia problema deben permitir el cálculo del balance de masas y la expresión de los resultados sobre la base de las concentraciones iniciales medidas. En general, el muestreo perturba o destruye el sistema sedimento-agua. Por lo tanto, no suele ser posible utilizar las mismas réplicas para la toma de muestras del sedimento y de los gusanos. Hay que preparar recipientes “analíticos” adicionales de dimensiones adecuadas, tratados de la misma manera (incluida la presencia de los organismos de ensayo) pero que no se utilizan para las observaciones biológicas. Las dimensiones del recipiente deben seleccionarse para proporcionar los volúmenes de muestra requeridos por el método analítico. En el punto 53 se recogen datos sobre el muestreo.
REALIZACIÓN DEL ENSAYO
Ensayo preliminar
31.
Cuando no se disponga de información sobre la toxicidad de la sustancia problema para Lumbriculus variegatus, puede ser útil proceder a un experimento preliminar para determinar el intervalo de concentraciones adecuadas para el ensayo definitivo, y para optimizar las condiciones de realización del ensayo definitivo. Con este fin se utiliza una serie de concentraciones de la sustancia problema, muy diferentes entre sí. Los gusanos se exponen a cada concentración de la sustancia problema durante un plazo (por ejemplo, 28 días como en el ensayo definitivo) que permita la estimación de las concentraciones de ensayo adecuadas; no hace falta utilizar réplicas. Debe observarse y registrarse durante el ensayo preliminar el comportamiento de los gusanos, por ejemplo una tendencia a evitar el sedimento, que pueda deberse a la sustancia problema o al sedimento. No deben utilizarse en el ensayo preliminar concentraciones superiores a 1 000 mg/kg de peso seco del sedimento.
Ensayo definitivo
32.
En el ensayo definitivo deben utilizarse al menos cinco concentraciones seleccionadas, por ejemplo, sobre la base del resultado del ensayo preliminar de determinación del intervalo (punto 31), según se describe en los puntos 35, 36, 37 y 38.
33.
Además de la serie de ensayo se prepara un control (sobre las réplicas, véanse los puntos 36, 37 y 38) con todos los componentes salvo la sustancia problema. Si se utiliza algún agente solubilizante para la aplicación de la sustancia problema, no debe tener ningún efecto significativo sobre los organismos de ensayo, lo cual ha de demostrarse mediante un control adicional que solo contenga disolvente.
Diseño del ensayo
34.
El diseño del ensayo se refiere a la selección del número de concentraciones de ensayo y al intervalo entre las mismas, al número de recipientes por concentración y al número de gusanos añadidos a cada recipiente. Los diseños para la estimación de ECx, para la estimación de la NOEC, y para realizar un ensayo límite se describen en los puntos 35, 36, 37 y 38.
35.
La concentración con efecto (por ejemplo, EC50 EC25, EC10) y el rango de concentraciones a las que resulta interesante el efecto de la sustancia problema tienen que estar abarcados entre las concentraciones incluidas en el ensayo. Debe evitarse extrapolar muy por debajo de la concentración mínima que afecta a los organismos de ensayo o por encima de la mayor concentración estudiada. Si —en casos excepcionales— se lleva a cabo tal extrapolación, es preciso dar una explicación completa en el informe.
36.
Si ha de estimarse la ECx, deben someterse a ensayo al menos cinco concentraciones y un mínimo de tres réplicas por cada concentración; se recomienda utilizar seis réplicas para el control o —en caso de que se utilice— para el control del disolvente, a fin de mejorar la estimación de la variabilidad del control. En cualquier caso, es recomendable utilizar suficientes concentraciones de ensayo para poder hacer una buena estimación del modelo. El factor entre concentraciones no debe ser mayor de dos (puede permitirse una excepción en los casos en que la pendiente de la curva dosis-respuesta sea poco pronunciada). El número de réplicas de cada tratamiento puede reducirse si aumenta el número de concentraciones de ensayo con respuestas en el intervalo del 5–95 %. El aumento del número de réplicas o la reducción del tamaño del intervalo entre concentraciones de ensayo tiende a estrechar los intervalos de confianza del ensayo.
37.
Si hay que estimar los valores de LOEC/NOEC, deben utilizarse al menos cinco concentraciones de ensayo con un mínimo de cuatro réplicas (se recomiendan seis réplicas para el control o —en caso de que se utilice— para el control del disolvente, a fin de mejorar la estimación de la variabilidad del control), y el factor entre concentraciones no debe exceder de dos. En el apéndice 6 figura información sobre la potencia estadística constatada durante los contrastes de hipótesis en el ensayo interlaboratorios del método de ensayo.
38.
Puede llevarse a cabo un ensayo límite (con una sola concentración de ensayo y controles) si no se esperan efectos a concentraciones de hasta 1 000 mg/kg de peso seco de sedimento (p. ej., a partir de datos de un ensayo preliminar de determinación del intervalo), o si el ensayo con una sola concentración es adecuado para confirmar un valor NOEC de interés. En este último caso, debe incluirse en el informe del ensayo una justificación detallada de la selección de la concentración límite. La finalidad del ensayo límite es someter a ensayo una concentración suficientemente elevada como para permitir a los responsables excluir cualquier efecto tóxico de la sustancia problema, y el límite se establece a una concentración que no se espera encontrar en la realidad en ninguna situación. Se recomienda la concentración de 1 000 mg/kg (peso seco). Generalmente hacen falta al menos seis réplicas tanto de las unidades de tratamiento como de las de control. En el apéndice 6 figura información sobre la potencia estadística constatada durante los contrastes de hipótesis en el ensayo interlaboratorios del método de ensayo.
Condiciones de exposición
Organismos de ensayo
39.
La prueba se lleva a cabo con al menos diez gusanos en cada réplica utilizada para la determinación de los parámetros biológicos. Este número de gusanos corresponde aproximadamente a 50-100 mg de biomasa húmeda. Suponiendo un contenido seco del 17,1 % (48), esto resulta aproximadamente en 9-17 mg de biomasa seca por recipiente. La EPA estadounidense (2000 (7)) recomienda utilizar una tasa de carga inferior o igual a 1:50 (biomasa seca: COT). Para el sedimento artificial descrito en el punto 22, esto representa aproximadamente 43 g de sedimento (peso seco) por diez gusanos con un contenido de carbono orgánico total (COT) de un 2,0 % de sedimento seco. En los casos en que se utilicen más de diez gusanos por recipiente, el importe del sedimento y del agua sobrenadante debe ajustarse en consecuencia.
40.
Todos los gusanos empleados en un ensayo deben proceder de la misma fuente, y su estado fisiológico debe ser similar (véase el apéndice 5). Deben seleccionarse gusanos de tamaño similar (véase el punto 39). Se recomienda pesar una submuestra del lote o población de gusanos antes del ensayo, para calcular el peso medio.
41.
Se toman del cultivo los gusanos que se vayan a utilizar en un ensayo (véanse más detalles en el anexo 5). Se toman animales grandes (adultos) que no muestren signos de fragmentación reciente y se transfieren a placas de vidrio (p. ej., placas Petri) que contengan agua limpia. A continuación se sincronizan según el método descrito en el apéndice 5. Después de la regeneración durante un período de 10 a 14 días, deben utilizarse para el ensayo gusanos completos de tamaño similar, que naden o se arrastren activamente tras un suave estímulo mecánico. Si las condiciones de ensayo son diferentes de las condiciones de cultivo (por ejemplo, en cuanto a la temperatura, régimen de luz y agua sobrenadante), una fase de aclimatación de 24 h a la temperatura, régimen de luz, y con la misma agua sobrenadante que en el ensayo debe ser suficiente para que los gusanos se adapten a las condiciones de ensayo. Los oligoquetos adaptados deben asignarse aleatoriamente a los recipientes de ensayo.
Alimentación
42.
Dado que se añade alimento al sedimento antes de la aplicación de la sustancia problema (o durante la misma), los gusanos no reciben alimentación adicional durante el ensayo.
Luz y temperatura
43.
El fotoperíodo en el cultivo y el ensayo suele ser de 16 horas (3), (7). La intensidad luminosa debe mantenerse baja (por ejemplo, de 100 a 500 lx) para imitar las condiciones naturales en la superficie del sedimento, y se mide al menos una vez durante el período de exposición. La temperatura debe ser de 20 °C ± 2 °C en toda la duración del ensayo. En una determinada fecha de medición, la diferencia de temperatura entre los recipientes de ensayo no debe ser superior a ± 1 °C. Los recipientes de ensayo deben colocarse en la incubadora de ensayo o en la zona de ensayo de forma aleatoria, por ejemplo con el fin de minimizar los sesgos de reproducción debido a la ubicación del recipiente.
Aireación
44.
El agua sobrenadante de los recipientes de ensayo debe airearse suavemente (por ejemplo, 2 - 4 burbujas por segundo) mediante una pipeta Pasteur situada aprox. 2 cm por encima de la superficie del sedimento, con el fin de reducir al mínimo la perturbación de este. Se debe procurar que la concentración de oxígeno disuelto no caiga por debajo del 30 % del valor de saturación de aire). El suministro de aire debe medirse y, si fuera necesario, ajustarse al menos una vez al día durante los días laborables.
Medición de la calidad del agua
45.
Deben medirse en el agua sobrenadante los siguientes parámetros de calidad del agua:
Temperatura:
al menos en un recipiente de ensayo de cada nivel de concentración y en un recipiente de los controles una vez por semana y al inicio y al final del período de exposición; si es posible, la temperatura en el medio ambiente (aire ambiente o baño de agua) podrá registrarse también, por ejemplo a intervalos de una hora;
Concentración de oxígeno disuelto:
al menos en un recipiente de ensayo de cada nivel de concentración y en un recipiente de los controles una vez por semana y al inicio y al final del período de exposición; expresado en mg/l y en % del valor de saturación de aire;
Suministro de aire:
debe medirse por lo menos una vez al día durante los días laborables y, si fuera necesario, ajustarse;
pH:
al menos en un recipiente de ensayo de cada nivel de concentración y en un recipiente de los controles una vez por semana y al inicio y al final del período de exposición;
Dureza total del agua:
al menos en una réplica de los controles y en un recipiente de ensayo del nivel más elevado de concentración al inicio y al final del período de exposición; expresada en mg/l CaCO3;
Contenido total de amoníaco:
al menos en una réplica de los controles y en un recipiente de ensayo de cada nivel de concentración al inicio del período de exposición y, posteriormente, 3 veces por semana; expresado en mg/l NH4 + o NH3 o en N amoniacal total.
Si la medición de los parámetros de calidad del agua exige la extracción de muestras significativas de agua de los recipientes, puede ser aconsejable establecer recipientes aparte para las mediciones de la calidad del agua, a fin de no alterar la relación agua-sedimento en volumen.
Observaciones biológicas
46.
Durante la exposición, hay que observar los recipientes de ensayo a fin de comprobar visualmente las eventuales diferencias de comportamiento de los gusanos (por ejemplo, tendencia a evitar el sedimento, deyecciones visibles en la superficie del sedimento) en comparación con los controles. Las observaciones se registrarán.
47.
Al final del ensayo se examina cada réplica (pueden excluirse del examen los recipientes adicionales reservados para los análisis químicos). Debe utilizarse un método conveniente para recuperar la totalidad de los gusanos del recipiente de ensayo. Debe tenerse cuidado para recuperar todos los gusanos sin lesionarlos. Un método posible es el tamizado de los gusanos a partir del sedimento. Puede utilizarse una malla de acero inoxidable de una luz adecuada. Se decanta con cuidado la mayor parte del agua sobrenadante, y el agua restante se agita con el sedimento para producir un lodo, que puede pasarse a través del tamiz. Con una luz de 500 μm, la mayoría de las partículas del sedimento pasará el tamiz con gran rapidez; sin embargo, el cribado debe hacerse con rapidez, a fin de impedir que los gusanos se arrastren al interior o a través de la luz. Con una luz de 250 μm se impedirá a los gusanos arrastrarse al interior o a través de la luz; no obstante, se debe tener cuidado para que quede retenida en el tamiz la menor cantidad posible de partículas del sedimento. El lodo tamizado de cada uno de los recipientes replicados puede pasarse por el tamiz una segunda vez a fin de garantizar que se recuperan todos los gusanos. Un método alternativo podría ser el calentamiento del sedimento colocando los recipientes de ensayo en un baño de agua a 50-60 °C; los gusanos saldrán del sedimento, y podrán recogerse de su superficie mediante el uso de una pipeta de boca ancha pulida al fuego. Otro método alternativo podría consistir en obtener un lodo del sedimento y verterlo en una bandeja poco profunda de tamaño adecuado. A partir de la capa somera de lodo, es posible recoger los gusanos con una aguja de acero o unas pinzas de relojero (que deben utilizarse más bien como horquilla que como pinzas, para evitar dañar a los gusanos) y transferirlos a agua limpia. Después de extraer los gusanos del lodo de sedimento, se lavan en el medio de ensayo y se cuentan.
48.
Con independencia del método utilizado, los laboratorios deben demostrar que su personal es capaz de recuperar una media del 90 % como mínimo de los organismos del conjunto del sedimento. Por ejemplo, podría añadirse al sedimento de los controles o al sedimento de ensayo un cierto número de organismos de ensayo, y determinarse la recuperación después de 1 h (7).
49.
Debe registrarse y evaluarse el número total de ejemplares vivos y muertos por réplica. Se consideran muertos los gusanos que pertenecen a los siguientes grupos:
a)
no presentan ninguna reacción después de un suave estímulo mecánico;
b)
presentan signos de descomposición [en combinación con la letra a)];
c)
falta cierto número de gusanos.
Por otra parte, los gusanos vivos pueden asignarse a uno de los tres grupos siguientes:
a)
gusanos completos grandes (adultos) sin regiones corporales regeneradas;
b)
gusanos completos con regiones corporales regeneradas, de color más claro (es decir, con la parte posterior nueva, con la parte anterior nueva, o con las partes anterior y posterior nuevas);
c)
gusanos incompletos (es decir, gusanos fragmentados recientemente con regiones corporales no regeneradas).
Estas observaciones adicionales no son obligatorias, pero pueden usarse para mejorar la interpretación de los resultados biológicos [por ejemplo, un alto número de gusanos asignados al grupo c) puede indicar un retraso de la reproducción o de la regeneración en un determinado tratamiento]. Además, debe registrarse si se observa alguna diferencia de aspecto (por ejemplo, lesiones en el tegumento, secciones corporales edematosas) entre los gusanos tratados y los de control.
50.
Inmediatamente después del recuento o evaluación, los gusanos vivos encontrados en cada réplica se transfieren a platillos de balanza secos, previamente tarados y etiquetados (un platillo por réplica), y se matan poniendo una gota de etanol por platillo. Los platillos de balanza se colocan en una estufa a 100 ± 5 °C y se dejan secar durante una noche, tras lo cual se pesan, después de enfriarse en un desecador, y se determina el peso seco de los gusanos (de preferencia en g, con una precisión de al menos cuatro decimales).
51.
Además del peso seco total, puede determinarse el peso seco sin cenizas, como se describe en (49), para tener en cuenta los componentes inorgánicos procedentes del sedimento ingerido presente en el aparato digestivo de los gusanos.
52.
La biomasa se determina como biomasa total por réplica, incluidas los gusanos adultos y jóvenes. Los gusanos muertos no deben tenerse en cuenta para la determinación de la biomasa por réplica.
Verificación de las concentraciones de la sustancia problema
Muestreo
53.
Las muestras para el análisis químico de la sustancia problema deben tomarse al menos a la concentración más elevada y a una inferior, al menos al final de la fase de equilibrado (antes de añadir los organismos de ensayo) y al final del ensayo. Deben muestrearse para el análisis al menos el sedimento en bruto y el agua sobrenadante. Deben tomarse al menos dos muestras por matriz y tratamiento, en cada fecha de muestreo. Una de las dos muestras duplicadas puede almacenarse como reserva (para analizarse, por ejemplo, en el caso de que los análisis iniciales se sitúen fuera del intervalo del ± 20 % de la concentración nominal). En caso de propiedades químicas específicas, por ejemplo si se espera una rápida degradación de la sustancia problema, se podrá modificar el calendario de los análisis (por ejemplo, tomar muestras con mayor frecuencia, analizar más niveles de concentración) sobre la base de un juicio experto. En tal caso podrán tomarse muestras en fechas de muestreo intermedias (por ejemplo, el día 7 tras el inicio de la exposición).
54.
Deben tomarse muestras del agua sobrenadante, decantándola con cuidado o haciendo sifón, con objeto de reducir al mínimo la perturbación del sedimento. Debe señalarse el volumen de las muestras.
55.
Después de que se haya retirado el agua sobrenadante, el sedimento debe homogeneizarse y transferirse a un recipiente adecuado. Se registra el peso de la muestra de sedimento húmedo.
56.
Si se requiere además el análisis de la sustancia problema en el agua intersticial, las muestras de sedimento homogeneizadas y pesadas deben centrifugarse para obtener el agua intersticial. Por ejemplo, aproximadamente 200 ml del sedimento húmedo pueden cargarse en vasos de centrífuga de 250 ml. A continuación se centrifugan las muestras sin filtrar para aislar el agua intersticial, por ejemplo a 10 000 ± 600 × g durante 30 a 60 minutos a una temperatura no superior a la temperatura utilizada en el ensayo. Después de centrifugar, se decanta o se pipetea el sobrenadante, teniendo cuidado de no introducir partículas del sedimento, y se registra el volumen. Se registra el peso del precipitado de sedimento restante. Así se puede facilitar la estimación del balance de masas o la recuperación de la sustancia problema en el sistema agua-sedimento, si se determina en cada fecha de muestreo el peso del sedimento seco. En algunos casos puede resultar imposible analizar las concentraciones en el agua intersticial debido a que el tamaño de la muestra es demasiado pequeño.
57.
A falta de su análisis inmediato, todas las muestras deben conservarse siguiendo un método adecuado como, p. ej., en las condiciones de almacenamiento recomendadas para una degradación mínima de la sustancia problema particular (por ejemplo, las muestras tomadas del medio ambiente suelen conservarse a – 18 °C en la oscuridad). Antes de empezar el estudio ha de obtenerse información sobre las condiciones adecuadas de almacenamiento de la sustancia problema particular (por ejemplo, la duración y la temperatura del almacenamiento, los procedimientos de extracción, etc.).
Métodos analíticos
58.
Como la totalidad del procedimiento se rige principalmente por la exactitud, la precisión y la sensibilidad del método analítico utilizado para la sustancia problema, es necesario controlar experimentalmente que la precisión y la reproducibilidad del análisis químico, así como la recuperación de la sustancia problema de las muestras tanto de agua como de sedimento, son satisfactorias para el método particular, al menos a los niveles de concentración de ensayo más elevado y más bajo. Ha de comprobarse también que la sustancia problema no es detectable en las cámaras de control a concentraciones superiores al límite de cuantificación. En caso necesario, hay que corregir las concentraciones nominales para tener en cuenta las recuperaciones de la sustancia introducida en recipientes de control de calidad (por ejemplo, cuando la recuperación esté fuera del 80 - 120 % de la cantidad introducida). Todas las muestras deben manipularse a lo largo de todo el ensayo de manera que se minimicen la contaminación y las pérdidas (por ejemplo, derivadas de la adsorción de la sustancia problema al dispositivo de muestreo).
59.
Deben registrarse y consignarse en el informe la recuperación de la sustancia problema, el límite de cuantificación y el límite de detección en el sedimento y en el agua.
DATOS E INFORME
Tratamiento de los resultados
60.
Las principales variables de respuesta obligatorias del ensayo que han de evaluarse estadísticamente son la biomasa y el número total de gusanos por réplica. Con carácter facultativo, también pueden evaluarse la reproducción (como aumento del número de gusanos) y el crecimiento (como incremento de la biomasa seca). En este caso, debe obtenerse una estimación del peso seco de los gusanos al comienzo de la exposición mediante, por ejemplo, la medición del peso seco de una submuestra representativa del lote de gusanos sincronizados que se vaya a utilizar en el ensayo.
61.
Aunque la mortalidad no es un parámetro de este ensayo, debe evaluarse en la medida de lo posible. Con el fin de estimar la mortalidad, se consideran muertos los gusanos que no responden a un suave estímulo mecánico o que muestran signos de descomposición, así como los gusanos que falten. La mortalidad debe al menos registrarse y tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados del ensayo.
62.
Las concentraciones con efecto deben expresarse en mg/kg de peso seco del sedimento. Si la recuperación de la sustancia problema medida en el sedimento, o en el sedimento y el agua sobrenadante al comienzo de la exposición, se sitúa entre el 80 y el 120 % de las concentraciones nominales, las concentraciones con efecto (ECx, NOEC, LOEC) podrán expresarse sobre la base de las concentraciones nominales. Si la recuperación se aparta de las concentraciones nominales en más del ± 20 % de las concentraciones nominales, las concentraciones con efecto (ECx, NOEC, LOEC) deberán basarse en las concentraciones medidas al inicio de la exposición, por ejemplo teniendo en cuenta el balance de masas de la sustancia problema en el sistema de ensayo (véase el punto 30). En estos casos, puede obtenerse información adicional del análisis de las soluciones madre o de aplicación con el fin de confirmar que los sedimentos de ensayo se han preparado correctamente.
ECx
63.
Los valores de ECx para los parámetros descritos en el punto 60 se calculan utilizando métodos estadísticos apropiados (por ejemplo, análisis de probit, función logística o de Weibull, método de Spearman-Karber recortado o interpolación simple). En las referencias (15) y (50) se dan orientaciones sobre la evaluación estadística. Se obtiene una ECx insertando en la ecuación encontrada un valor correspondiente al x % de la media del control. Para calcular la EC50 o alguna otra ECx, las medias por tratamiento ( Formula
) deben someterse a análisis de regresión.
NOEC/LOEC
64.
Cuando se pretende determinar la NOEC/NOEL mediante análisis estadístico, es necesario disponer de estadísticas por recipiente (se considera que cada uno de los recipientes es una réplica). Se deben utilizar métodos estadísticos apropiados. En general, los efectos adversos de la sustancia problema en comparación con el control se investigan utilizando contrastes de hipótesis unilaterales (más pequeños) a p ≤ 0,05. En los puntos siguientes se presentan ejemplos. En las referencias (15) y (50) se dan orientaciones sobre la selección de métodos estadísticos adecuados.
65.
La distribución normal de los datos puede comprobarse, por ejemplo, con la prueba de la bondad del ajuste de Kolmogorov-Smirnov, la prueba de la relación del intervalo a la desviación típica (prueba R/s), o la prueba de Shapiro-Wilk) (bilateral, p ≤ 0,05). Para comprobar la homogeneidad de la varianza pueden utilizarse las pruebas de Cochran, de Levene o de Bartlett (bilateral, p ≤ 0,05). Si se cumplen los requisitos previos de los procedimientos de ensayos paramétricos (normalidad, homogeneidad de la varianza) puede efectuarse un análisis de la varianza (ANOVA) de un factor, seguido de pruebas de comparación múltiple. Las comparaciones de pares (p. ej., prueba t de Dunnett) o las pruebas de tendencia de ajuste secuencial (p. ej., prueba de Williams) pueden utilizarse para determinar si existen diferencias significativas (p ≤ 0,05) entre los controles y las distintas concentraciones de la sustancia problema. De lo contrario, para determinar la LOEC y la NOEC deben utilizarse métodos no paramétricos (p. ej., prueba U de Bonferroni según Holm o prueba de tendencia de Jonckheere-Terpstra).
Ensayo límite
66.
Si se realiza un ensayo límite (comparación del control y de un solo tratamiento) y se cumplen los requisitos previos de procedimientos de ensayos paramétricos (normalidad, homogeneidad), pueden evaluarse las respuestas métricas (número total de gusanos, y biomasa como peso seco de gusanos) con la prueba de Student (prueba t). Si estos requisitos no se satisfacen, puede utilizarse la prueba t de varianzas desiguales (prueba t de Welch) o una prueba no paramétrica, tal como la prueba U de Mann-Whitney. En el apéndice 6 figura información sobre la potencia estadística constatada durante los contrastes de hipótesis en el ensayo interlaboratorios del método.
67.
Para determinar la existencia de diferencias significativas entre los controles (control y control del disolvente), las réplicas de cada control pueden someterse a ensayo según lo descrito para el ensayo límite. En caso de que tales ensayos no detecten diferencias significativas, pueden agruparse todas las réplicas de control y de control del disolvente. En caso contrario, todos los tratamientos deben compararse con el control del disolvente.
Interpretación de los resultados
68.
Los resultados se interpretarán con precaución si ha habido alguna desviación respecto al presente método de ensayo y cuando las concentraciones medidas de las soluciones de ensayo se encuentren a niveles cercanos al límite de detección del método analítico utilizado. Deberán indicarse las eventuales desviaciones respecto al presente método de ensayo.
Informe del ensayo
69.
El informe del ensayo debe recoger, como mínimo, la siguiente información:
—
Sustancia problema:
—
datos de identificación de la sustancia (nombre común, nombre químico, fórmula estructural, número CAS, etc.), incluida la pureza y el método de análisis cuantitativo de la sustancia problema; fuente de la sustancia problema, identidad y concentración de los eventuales disolventes utilizados;
—
cualquier información disponible sobre la naturaleza física y propiedades fisicoquímicas obtenida antes del inicio del ensayo [por ejemplo, hidrosolubilidad, presión de vapor, coeficiente de reparto en el suelo (o en el sedimento, si se conoce), log Kow, estabilidad en el agua, etc.];
—
Especie de ensayo:
—
denominación científica, fuente, eventuales tratamientos previos, aclimatación, condiciones de cultivo, etc.;
—
Condiciones del ensayo:
—
procedimiento de ensayo aplicado (p. ej., estático, semiestático o dinámico);
—
diseño del ensayo (p. ej., número, material y tamaño de las cámaras de ensayo, volumen de agua por recipiente, masa y volumen del sedimento por recipiente, (en caso de procedimiento dinámico o semiestático: tasa de renovación del volumen de agua), eventual aireación antes del ensayo y durante el mismo, número de réplicas, número de gusanos por réplica al inicio de la exposición, número de concentraciones de ensayo, duración de los períodos de acondicionamiento, de equilibrado y de exposición, frecuencia del muestreo);
—
altura del sedimento y del agua sobrenadante;
—
método de pretratamiento y de enriquecimiento o aplicación de la sustancia problema;
—
concentraciones nominales de ensayo, información detallada sobre el muestreo para el análisis químico, y métodos analíticos con los que se han determinado las concentraciones de la sustancia problema;
—
características de los sedimentos según se describen en los puntos 24-25, y las demás medidas eventualmente realizadas; preparación del sedimento artificial;
—
preparación del agua de ensayo (si se utiliza agua reconstituida) y características (concentración de oxígeno, pH, conductividad, dureza, y cualquier otra medición realizada) antes del inicio del ensayo;
—
información detallada sobre la alimentación de los animales, incluidos el tipo de alimento, la preparación, la cantidad y el régimen alimentario;
—
intensidad luminosa y fotoperíodo (s);
—
métodos utilizados para la determinación de todos los parámetros biológicos (p. ej., muestreo, inspección, pesada de los organismos de ensayo) y todos los parámetros abióticos (p. ej., parámetros de calidad del agua y del sedimento);
—
volúmenes o pesos de todas las muestras para el análisis químico;
—
información pormenorizada sobre el tratamiento de todas las muestras para el análisis químico, incluidos datos de la preparación, almacenamiento, métodos de adición de la sustancia problema (enriquecimiento), extracción y procedimientos analíticos (y precisión del análisis) de la sustancia problema, y recuperaciones de la sustancia problema;
—
Resultados:
—
calidad del agua en los recipientes de ensayo (pH, temperatura, concentración de oxígeno disuelto, dureza, concentraciones de amoniaco, y cualquier otra medición realizada);
—
contenido de carbono orgánico total (COT), relación de peso seco a peso húmedo, pH del sedimento, y cualquier otra medición realizada;
—
número total y, si se ha determinado, número de gusanos completos e incompletos en cada cámara de ensayo al final del ensayo;
—
peso seco de los gusanos de cada cámara de ensayo al final del ensayo y, si se mide, peso seco de una submuestra de los gusanos al inicio del ensayo;
—
eventuales comportamientos anormales observados en comparación con los controles (por ejemplo, tendencia a evitar el sedimento, presencia o ausencia de deyecciones);
—
eventual mortalidad observada;
—
estimación de los parámetros de toxicidad (p. ej., ECx, NOEC o LOEC), y métodos estadísticos empleados para su determinación;
—
concentraciones de ensayo nominales, concentraciones de ensayo medidas y resultados de todos los análisis efectuados para determinar la concentración de la sustancia problema en los recipientes de ensayo;
—
eventuales desviaciones respecto de los criterios de validez;
—
Evaluación de los resultados:
—
cumplimiento por los resultados de los criterios de validez recogidos en el punto 13;
—
discusión de los resultados, incluida la influencia que puedan tener sobre ellos las eventuales desviaciones respecto al presente método de ensayo.
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(6)
Capítulo C.27 del presente anexo, “Ensayo de toxicidad para quironómidos en sistemas sedimento-agua con sedimento enriquecido”.
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(32)
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(36)
Brinkhurst, R.O. (1971). A guide for the identification of British aquatic oligochaeta. Freshw. Biol. Assoc., Sci. Publ. No. 22.
(37)
Capítulo C.1 del presente anexo: Toxicidad aguda en peces.
(38)
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(39)
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Apéndice 1
Definiciones
A efectos del presente método de ensayo, se aplicarán las siguientes definiciones:
Sustancia: sustancia o mezcla.
El período de acondicionamiento se utiliza para estabilizar el componente microbiano del sedimento y eliminar, por ejemplo, el amoníaco procedente de los componentes del sedimento; tiene lugar antes del enriquecimiento del sedimento con la sustancia problema. Por lo general, el agua sobrenadante se descarta tras el acondicionamiento.
ECx : concentración de la sustancia problema en el sedimento que da lugar a un efecto del X % (por ejemplo, del 50 %) en un parámetro biológico dentro del período de exposición establecido.
El período de equilibrado se utiliza para permitir la distribución de la sustancia problema entre la fase sólida, el agua intersticial y el agua sobrenadante; tiene lugar tras el enriquecimiento del sedimento con la sustancia problema y antes de que se añadan los organismos de ensayo.
Fase de exposición: tiempo durante el cual los organismos de ensayo se exponen a la sustancia problema.
Sedimento artificial (o sedimento reconstituido, formulado o sintético): mezcla de materiales empleada para imitar los componentes físicos de un sedimento natural.
Concentración mínima con efecto observado (LOEC): concentración más baja de sustancia problema que se ha empleado en el ensayo con la que se observa un efecto tóxico significativo (a p ≤ 0,05) en comparación con el control. Sin embargo, es necesario también que todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC ejerzan un efecto superior o igual al que se observa con dicha concentración. Si no se cumplen estas dos condiciones, es preciso dar una explicación completa sobre cómo se ha elegido la LOEC (y, por tanto, la NOEC).
Concentración sin efecto observado (NOEC): concentración de ensayo inmediatamente inferior a la LOEC que, en comparación con el control, no ejerce ningún efecto estadísticamente significativo (p ≤ 0,05) dentro del período de exposición establecido.
Coeficiente de reparto octanol/agua (Kow; expresado a veces como Pow): es la relación entre la solubilidad de una sustancia en n-octanol y en agua, en equilibrio, y representa la lipofilia de la sustancia (capítulo A.24 del presente anexo). Se utiliza Kow (o su logaritmo, log Kow) como indicación del potencial de bioacumulación de una sustancia por los organismos acuáticos.
Coeficiente de reparto carbono orgánico-agua (Koc): relación de la concentración de una sustancia en la fracción de carbono orgánico de un sedimento respecto a su concentración en el agua, en equilibrio.
Agua sobrenadante: agua que cubre el sedimento en el recipiente de ensayo.
Agua intersticial: agua que ocupa el espacio entre las partículas de sedimento o de suelo.
Sedimento enriquecido: sedimento al que se ha añadido sustancia problema.
Sustancia problema: sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.
Apéndice 2
Composición del agua reconstituida recomendada
[tomada del capítulo C.1 del presente anexo (1)]
a)
Solución de cloruro de calcio
Se disuelven 11,76 g CaCl2 · 2H2O en agua desionizada; se enrasa a 1 l con agua desionizada.
b)
Solución de sulfato de magnesio
Se disuelven 4,93 g MgSO4 · 7H2O en agua desionizada; se enrasa a 1 l con agua desionizada.
c)
Solución de bicarbonato de sodio
Se disuelven 2,59 g NaHCO3 en agua desionizada; se enrasa a 1 l con agua desionizada.
d)
Solución de cloruro de potasio
Se disuelven 0,23 g KCl en agua desionizada; se enrasa a 1 l con agua desionizada.
Los productos químicos deben ser de calidad analítica.
La conductividad del agua destilada o desionizada no debe ser mayor de 10 μScm– 1.
Se mezclan 25 ml de cada una de las soluciones a) a d) y el volumen total se lleva a 1 l con agua desionizada. La suma de los iones de calcio y de magnesio en estas soluciones es igual a 2,5 mmol/l.
La relación de los iones Ca:Mg es de 4:1 y la de los iones Na:K, de 10:1. La alcalinidad o capacidad de ácido KS4.3 de esta solución es de 0,8 mmol/l.
Se airea el agua de dilución hasta que se alcance la saturación de oxígeno y, a continuación, se conserva durante unos dos días sin más aireación antes de su utilización.
BIBLIOGRAFÍA
(1)
Capítulo C.1 del presente anexo: Toxicidad aguda en peces.
Apéndice 3
Características FISICOQUÍMICAS DE UN AGUA DE DILUCIÓN ACEPTABLE
Componente
Concentraciones
Partículas
< 20 mg/l
Carbono orgánico total
< 2 μg/l
Amoníaco no ionizado
< 1 μg/l
Cloro residual
< 10 μg/l
Plaguicidas organofosforados totales
< 50 ng/l
Plaguicidas organoclorados totales y bifenilos policlorados
< 50 ng/l
Cloro orgánico total
< 25 ng/l
[adoptada de OCDE (1992) (1)]
Bibliografía
(1)
OCDE (1992). Guidelines for Testing of Chemicals No. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OCDE, París.
Apéndice 4
Sedimento artificial recomendado: orientaciones sobre la preparación y el almacenamiento
Componentes del sedimento
Componente
Características
Porcentaje de peso seco de sedimento
Turba
Turba esfágnea, grado de descomposición: “medio”, secada al aire, sin restos vegetales visibles, finamente molida (tamaño de partícula ≤ 0,5 mm)
5 ± 0,5
Arena de cuarzo
Granulometría: ≤ 2 mm, pero > 50 % de las partículas deben encontrarse en la banda de 50 - 200 μm
75 - 76
Caolín
Contenido en caolinita ≥ 30 %
20 ± 1
Fuente de alimento
Por ejemplo, polvo de Urtica (Folia Urticae), hoja de Urtica dioica (ortiga), finamente molida (tamaño de partícula ≤ 0,5 mm); de conformidad con normas farmacéuticas, para consumo humano; además del sedimento seco
0,4 - 0,5 %)
Carbono orgánico
Ajustado mediante adición de turba y arena
2 ± 0,5
Carbonato de calcio
CaCO3, pulverizado, químicamente puro, además del sedimento seco
0,05 - 1
Agua desionizada
Conductividad ≤ 10 μS/cm, además del sedimento seco
30 - 50
Nota: Si se esperan elevadas concentraciones de amoníaco, por ejemplo si se sabe que la sustancia problema inhibe la nitrificación, puede ser útil sustituir un 50 % del polvo de ortiga, rico en nitrógeno, por celulosa [por ejemplo, α-celulosa en polvo, químicamente pura, tamaño de partícula ≤ 0,5 mm; (1, 2)].
Preparación
La turba se seca al aire y se tritura hasta convertirse en un polvo fino. Se prepara en agua desionizada una suspensión de la cantidad necesaria de polvo de turba, utilizando un dispositivo de homogeneización de prestaciones elevadas. El pH de esta suspensión se ajusta a 5,5 ± 0,5 con CaCO3. La suspensión se deja durante al menos dos días con agitación suave a 20 ± 2 °C, para estabilizar el pH e implantar un componente microbiano estable. Se vuelve a medir el pH, que debe estar a 6,0 ± 0,5. A continuación se mezcla la suspensión de turba con los demás componentes (arena y caolín) y con agua desionizada para obtener un sedimento homogéneo con un contenido de agua del 30–50 % del peso seco del sedimento. Se vuelve a medir el pH de la mezcla final y se ajusta a 6,5-7,5 con CaCO3 en caso necesario. No obstante, si se espera que se produzca amoníaco, puede ser útil mantener el pH del sedimento por debajo de 7,0 (por ejemplo, entre 6,0 y 6,5). Se toman muestras del sedimento para determinar el peso seco y el contenido de carbono orgánico. Si se espera que se produzca amoníaco, el sedimento artificial puede dejarse durante siete días en las mismas condiciones que vayan a darse posteriormente en el ensayo (por ejemplo, relación sedimento-agua de 1:4, altura de la capa de sedimento como en los recipientes de ensayo) antes de enriquecerse con la sustancia problema, es decir, debe cubrirse con agua, que ha de airearse. Al final de este período de acondicionamiento, el agua sobrenadante debe retirarse y eliminarse. A continuación, la arena de cuarzo enriquecida con la sustancia problema se mezcla con el sedimento para cada nivel de tratamiento, el sedimento se reparte en los recipientes de ensayo replicados, y se cubre con el agua de ensayo. Los recipientes se incuban a continuación en las mismas condiciones que vayan a darse posteriormente en el ensayo. Entonces es cuando comienza el período de equilibrado. El agua sobrenadante debe airearse.
La fuente elegida de alimento debe añadirse antes del enriquecimiento del sedimento con la sustancia problema, o durante el mismo. Puede mezclarse con la suspensión de turba al principio (véase más arriba). No obstante, puede evitarse la degradación excesiva de la fuente de alimento antes de añadir los organismos de ensayo —por ejemplo, en caso de que sea largo el período de equilibrado— reduciendo al mínimo el tiempo transcurrido entre la adición de alimento y el inicio de la exposición. Con el fin de garantizar que el alimento está añadido con la sustancia problema, la fuente de alimento debe mezclarse con el sedimento como muy tarde el día en que la sustancia problema se introduce en el sedimento.
Almacenamiento
Los componentes secos del sedimento artificial pueden almacenarse en un lugar fresco y seco, o a temperatura ambiente. El sedimento preparado enriquecido con la sustancia problema debe utilizarse en el ensayo inmediatamente. Hasta el momento de su análisis, es posible conservar, en las condiciones recomendadas para las sustancia problema concreta, muestras del sedimento enriquecido.
BIBLIOGRAFÍA
(1)
(2)
Apéndice 5
Métodos de cultivo de Lumbriculus variegatus
El organismo Lumbriculus variegatus (Müller), Lumbriculidae, Oligochaeta, es un habitante de los sedimentos de agua dulce, y se utiliza ampliamente en ensayos ecotoxicológicos. Puede cultivarse fácilmente en condiciones de laboratorio. A continuación se recoge una descripción general de los métodos de cultivo.
Métodos de cultivo
Las condiciones de cultivo de Lumbriculus variegatus se detallan en Phipps et al. (1993) (1), Brunson et al. (1998) (2), ASTM (2000) (3), y U.S. EPA (2000) (4). Un breve resumen de estas condiciones figura a continuación. Una importante ventaja de L. variegatus es su rápida reproducción, lo que se traduce en el veloz aumento de la biomasa de las poblaciones cultivadas en laboratorio [por ejemplo, (1), (3), (4), (5)].
Los gusanos pueden someterse a cultivo en acuarios grandes (57-80 l) a 23 °C con un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad (100-1 000 lx) utilizando agua natural renovada diariamente (45-50 l por acuario). El sustrato se prepara cortando en tiras servilletas de papel marrón sin blanquear, que pueden mezclarse a continuación con agua de cultivo durante unos segundos, para dar lugar a pequeños fragmentos de sustrato de papel. Este sustrato puede entonces utilizarse directamente en los acuarios de cultivo de Lumbriculus, cubriendo la superficie del fondo del tanque, o conservarse congelado en agua desionizada para su uso posterior. Un sustrato nuevo puesto en el tanque suele durar aproximadamente dos meses.
Cada cultivo de gusanos comienza con 500-1 000 gusanos y se alimenta 3 veces por semana con 10 ml de suspensión que contienen 6 g de comida para cultivo inicial de truchas, en condiciones dinámicas o de renovación. Los cultivos estáticos o semiestáticos deben recibir alimentos a una dosis inferior para evitar el crecimiento de hongos y bacterias.
En estas condiciones, el número de individuos presentes en el cultivo se duplica, por lo general, cada 10 o 14 días.
Otra posibilidad consiste en cultivar Lumbriculus variegatus en un sistema consistente en una capa de arena de cuarzo utilizada para el sedimento artificial (1-2 cm de profundidad) y agua reconstituida. Pueden utilizarse para el cultivo recipientes de vidrio o de acero inoxidable con una altura de 12 a 20 cm. El agua debe airearse suavemente (por ejemplo, 2 burbujas por segundo) mediante una pipeta Pasteur situada a unos 2 cm por encima de la superficie del sedimento. Para evitar la acumulación de, p. ej., amoníaco, el agua sobrenadante debe cambiarse utilizando un sistema dinámico, o bien de forma manual, al menos una vez por semana. Los oligoquetos pueden mantenerse a temperatura ambiente con un fotoperíodo de 16 horas de luz (de intensidad de 100 a 1 000 lx) y 8 horas de oscuridad. En el cultivo semiestático (renovación del agua una vez por semana), los gusanos se alimentan dos veces por semana con TetraMin (p. ej., de 0,6 a 0,8 mg por cm2 de superficie del sedimento), que puede aplicarse en forma de suspensión de 50 mg de TetraMin por ml de agua desionizada.
Pueden retirarse de los cultivos los ejemplares de Lumbriculus variegatus, por ejemplo transfiriendo sustrato con una red de malla fina a otro vaso de precipitados, o tomando solo los organismos con una pipeta de vidrio de boca ancha pulida al fuego (de unos 5 mm de diámetro). Si a ese otro vaso de precipitados se transfiere a la vez sustrato, el vaso de precipitados que contenga sustrato y gusanos se deja una noche en condiciones dinámicas, con lo que se eliminará el sustrato del vaso, mientras que los gusanos se mantendrán en el fondo del recipiente. Estos pueden introducirse en tanques de cultivo recién preparados, o seguir el procedimiento para el ensayo, tal como se indica en las referencias (3) y (4), o a continuación.
Una cuestión que debe considerarse de forma crítica si se utiliza L. variegatus en pruebas con sedimentos es su modo de reproducción [arquitomía o morfalaxis (véase, p. ej., (6)]. Esta reproducción asexual resulta en dos fragmentos, que no se alimentan durante un determinado período de tiempo, hasta que se regenera la cabeza o la cola [por ejemplo, (7), (8)]. Esto significa que en L. variegatus la exposición por ingestión de sedimento contaminado no tiene lugar de forma continua.
Por lo tanto, debe realizarse una sincronización para reducir al mínimo la reproducción y regeneración incontroladas, y la gran variación consiguiente en los resultados de los ensayos. Tal variación puede producirse en los casos en los que determinados individuos, que se han fragmentado y, por lo tanto, no se alimentan durante un cierto tiempo, están menos expuestos a la sustancia problema que otros individuos, que no se fragmentan durante el ensayo (9), (10), (11). Entre 10 y 14 días antes de la fecha de inicio de la exposición, los gusanos deben fragmentarse artificialmente (sincronización). Para esta sincronización deben seleccionarse gusanos grandes (adultos), que de preferencia no muestren signos de morfalaxis reciente. Estos gusanos pueden colocarse en un portaobjetos de vidrio con una gota de agua de cultivo, y diseccionarse por la región mediana del cuerpo con un bisturí. Debe velarse por que los extremos posteriores sean de tamaño similar. Debe dejarse entonces que los extremos posteriores regeneren nuevas cabezas en un recipiente de cultivo que contenga el mismo sustrato utilizado en el cultivo y agua reconstituida, hasta el inicio de la exposición. La regeneración de cabezas nuevas queda de manifiesto cuando los gusanos sincronizados se entierran en el sustrato (la presencia de cabezas regeneradas podrá confirmarse mediante la inspección de una submuestra representativa con un microscopio binocular). Se prevé que los organismos de ensayo se encontrarán después en un estado fisiológico similar. Esto significa que, cuando se produzca durante el ensayo la reproducción por morfalaxis en gusanos sincronizados, se espera que prácticamente todos los animales queden expuestos de la misma forma al sedimento enriquecido. Debe darse alimento a los gusanos sincronizados tan pronto como estos empiecen a enterrarse en el sustrato, o 7 días después de la disección. El régimen de alimentación debe ser comparable al de los cultivos normales, aunque podría ser recomendable alimentar los gusanos sincronizados con la misma fuente de alimento que se vaya a utilizar en el ensayo. Los gusanos deben mantenerse a la temperatura de ensayo, a 20 ± 2 °C. Después de la regeneración deben utilizarse para el ensayo gusanos completos intactos, que naden o se arrastren activamente tras un suave estímulo mecánico. Deben evitarse las lesiones o la autotomía de los gusanos, por ejemplo manipulándolos con pipetas de bordes pulidos al fuego, o palillos dentales de acero inoxidable.
Fuentes de cultivos iniciales de Lumbriculus variegatus [direcciones de los EE.UU. tomadas de (4)]
Europa
ECT Oekotoxikologie GmbH
Böttgerstr. 2-14
D-65439 Flörsheim/Main
Alemania
Bayer Crop Science AG
Development — Ecotoxicology
Alfred-Nobel-Str. 50
D-40789 Monheim
Alemania
University of Joensuu
Laboratory of Aquatic Toxicology
Dept. of Biology
Yliopistokatu 7, P.O. Box 111
FIN-80101 Joensuu
Finlandia
Dresden University of Technology
Institut für Hydrobiologie
Fakultät für Forst-, Geo- und Hydrowissenschaften
Mommsenstr. 13
D-01062 Dresde
Alemania
C.N.R.- I.R.S.A.
Italian National Research Council
Water Research Institute
Via Mornera 25
I-20047 Brugherio MI
EE.UU.
U.S. Environmental Protection Agency
Mid-Continent Ecological Division
6201 Congdon Boulevard
Duluth, MN 55804
Michigan State University
Department of Fisheries and Wildlife
No. 13 Natural Resources Building
East Lansing, MI 48824-1222
U.S. Environmental Protection Agency
Environmental Monitoring System Laboratory
26 W. Martin Luther Dr.
Cincinnati, OH 45244
Wright State University
Institute for Environmental Quality
Dayton, OH 45435
Columbia Environmental Research Center
U.S. Geological Survey
4200 New Haven Road
Columbia, MO 65201
Great Lakes Environmental Research
Laboratory, NOAA
2205 Commonwealth Boulevard
Ann Arbor, MI 48105-1593
BIBLIOGRAFÍA
(1)
Phipps, G.L., Ankley, G.T., Benoit, D.A. and Mattson, V.R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269-279.
(2)
(3)
ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. En: ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
(4)
U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
(5)
Kukkonen, J. and Landrum, P.F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457-1468.
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
Apéndice 6
Resumen de los resultados del ensayo interlaboratorios
“Ensayo de toxicidad del sedimento con Lumbriculus variegatus”
Cuadro 1.
Resultado de los distintos ciclos del ensayo interlaboratorios: número medio de los gusanos de los controles y de los controles de disolvente al final del ensayo; SD = desviación típica; CV = coeficiente de variación.
Número medio de gusanos en los controles
SD
CV (%)
n
Número medio de gusanos en los controles de disolvente
SD
CV (%)
n
32,3
7,37
22,80
3
39,0
3,61
9,25
3
40,8
6,55
16,05
6
36,0
5,29
14,70
3
41,5
3,54
8,52
2
38,5
7,05
18,31
4
16,3
5,99
36,67
6
30,8
6,70
21,80
4
24,3
10,69
43,94
3
26,3
3,06
11,60
3
28,5
8,29
29,08
4
30,7
1,15
3,77
3
28,3
3,72
13,14
6
28,8
2,56
8,89
6
25,3
5,51
21,74
3
27,7
1,53
5,52
3
23,8
2,99
12,57
4
21,3
1,71
8,04
4
36,8
8,80
23,88
6
35,0
4,20
11,99
6
33,0
3,58
10,84
6
33,5
1,73
5,17
4
20,7
2,73
13,22
6
15,0
6,68
44,56
4
42,0
7,07
16,84
6
43,7
0,58
1,32
3
18,2
3,60
19,82
6
21,7
4,04
18,65
3
32,0
3,95
12,34
6
31,3
4,79
15,32
4
Media interlaboratorios
29,59
20,10
30,61
13,26
SD
8,32
10,03
7,57
10,48
n
15
15
mín
16,3
15,0
máx
42,0
43,7
CV (%)
28,1
24,7
Cuadro 2.
Resultado de los distintos ciclos del ensayo interlaboratorios: peso seco total medio de los gusanos por réplica de los controles y de los controles de disolvente al final del ensayo; SD = desviación típica; CV = coeficiente de variación.
Peso seco total de los gusanos por réplica (controles)
SD
CV (%)
n
Peso seco total de los gusanos por réplica (controles de disolvente)
SD
CV (%)
n
24,72
6,31
25,51
3
27,35
4,08
14,93
3
30,17
2,04
6,75
6
33,83
10,40
30,73
3
23,65
3,61
15,25
2
28,78
4,68
16,28
4
12,92
6,83
52,91
6
24,90
6,84
27,47
4
21,31
4,17
19,57
3
25,87
5,30
20,49
3
22,99
4,86
21,16
4
24,64
5,09
20,67
3
18,91
1,91
10,09
6
19,89
1,77
8,89
6
24,13
1,63
6,75
3
25,83
2,17
8,41
3
22,15
3,18
14,34
4
22,80
2,60
11,40
4
35,20
8,12
23,07
6
31,42
8,45
26,90
6
41,28
5,79
14,02
6
41,42
4,37
10,55
4
15,17
5,78
38,09
6
10,50
3,42
32,53
4
35,69
8,55
23,94
6
38,22
1,23
3,21
3
19,57
5,21
26,65
6
28,58
6,23
21,81
3
29,40
2,16
7,34
6
31,15
2,70
8,67
4
Media interlaboratorios
25,15
20,36
27,68
17,53
SD
7,87
12,56
7,41
9,10
n
15
15
mín.
12,9
10,5
máx.
41,3
41,4
CV (%)
31,3
26,8
Cuadro 3.
Toxicidad del PCP: Resumen de los parámetros de la prueba interlaboratorios; medias interlaboratorios de EC50, NOEC y LOEC; SD = desviación típica; CV = coeficiente de variación.
Parámetro biológico
Media interlaboratorios (mg/kg)
mín
máx
Factor interlaboratorios
SD
CV (%)
Media geométr. (mg/kg)
Número total de gusanos
EC50
23,0
4,0
37,9
9,4
10,7
46,3
19,9
NOEC
9,9
2,1
22,7
10,7
7,2
72,3
7,6
LOEC
27,9
4,7
66,7
14,2
19,4
69,4
20,9
DDM (%)
22,5
7,1
39,1
Peso seco total de los gusanos
EC50
20,4
7,3
39,9
5,5
9,1
44,5
18,2
NOEC
9,3
2,1
20,0
9,4
6,6
70,4
7,4
LOEC
25,7
2,1
50,0
23,5
16,8
65,5
19,4
DDM (%)
24,8
10,9
44,7
Mortalidad/supervivencia
LC50
25,3
6,5
37,2
5,7
9,4
37,4
23,1
NOEC
16,5
2,1
40,0
18,8
10,3
62,4
12,8
LOEC
39,1
4,7
66,7
14,2
18,1
46,2
32,6
Reproducción (aumento del número de gusanos por réplica)
EC50
20,0
6,7
28,9
4,3
7,6
37,9
18,3
NOEC
7,9
2,1
20,0
9,4
5,2
66,0
6,4
LOEC
22,5
2,1
50,0
23,5
15,4
68,6
16,0
DDM (%)
29,7
13,9
47,9
Crecimiento (aumento de biomasa por réplica)
EC50
15,3
5,7
29,9
5,2
7,1
46,5
13,7
NOEC
8,7
2,1
20,0
9,4
6,0
68,1
6,9
LOEC
24,0
2,1
50,0
23,5
15,7
65,5
17,3
DDM (%)
32,2
13,6
65,2
DDM: diferencia detectable mínima respecto a los valores de control durante los contrastes de hipótesis; se utiliza como medida de la potencia estadística.
BIBLIOGRAFÍA
C.36. ENSAYO DE REPRODUCCIÓN DE UN ÁCARO PREDADOR [HYPOASPIS (GEOLAELAPS) ACULEIFER] EN EL SUELO
INTRODUCCIÓN
1.
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 226 (2008). El presente método de ensayo está diseñado para evaluar los efectos de las sustancias del suelo sobre el resultado reproductor de la especie de ácaro del suelo Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer Canestrini (Acari: Laelapidae), permitiendo así la estimación de la inhibición de la tasa específica de crecimiento de la población (1), (2). Por resultado reproductor se entiende aquí el número de juveniles al final del período de ensayo. H. aculeifer representa un nivel trófico adicional al de las especies para las que ya se dispone de métodos de ensayo. Para los fines del presente método de ensayo se considera adecuado un ensayo de reproducción sin discriminación ni cuantificación de las diferentes fases del ciclo reproductivo. Para las sustancias con una situación de exposición distinta de la exposición a través del suelo, podrían ser apropiados otros enfoques (3).
2.
Se considera que Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer es un representante pertinente de la fauna del suelo y de los ácaros predadores en particular. Presenta una distribución universal (5) y puede recogerse y criarse en el laboratorio fácilmente. En el apéndice 7 se recoge un resumen sobre la biología de H. aculeifer. Se dispone de datos previos sobre la ecología de esta especie de ácaros y sobre su utilización en ensayos ecotoxicológicos (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12).
PRINCIPIO DEL ENSAYO
3.
Se exponen hembras adultas a un intervalo de concentraciones de la sustancia problema mezclada con un suelo artificial. El ensayo se inicia con 10 hembras adultas por réplica (recipiente). En el ensayo no se introducen machos, ya que la experiencia ha demostrado que las hembras se aparean inmediatamente o poco después de salir de la fase de deutoninfa, si hay machos presentes. Además, la inclusión de los machos prolongaría el ensayo de manera que se haría necesaria una laboriosa discriminación de las fases de desarrollo. Así pues, el apareamiento en sí no forma parte del ensayo. Las hembras se introducen en el ensayo a los 28-35 días del inicio del período de puesta de huevos en el proceso de sincronización (véase el apéndice 4), ya que entonces puede considerarse que las hembras se han apareado y han superado la fase de preoviposición. A 20 °C, el ensayo termina el día 14 después de la introducción de las hembras (día 0), lo que permite que los primeros descendientes de los controles alcancen la fase de deutoninfa (véase el apéndice 4). Para obtener la variable principal medida, se determina el número de juveniles por recipiente de ensayo y, además, el número de hembras supervivientes. El resultado reproductor de los ácaros expuestos a la sustancia problema se compara con el de los controles para determinar la ECx (por ejemplo, EC10, EC50) o la concentración sin efecto observado (NOEC) (véanse las definiciones en el apéndice 1), dependiendo del diseño experimental (véase el punto 29). En el apéndice 8 figura un resumen del programa de ensayo.
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA
4.
Es preferible conocer la hidrosolubilidad, el log Kow, el coeficiente de reparto agua/suelo y la presión de vapor de la sustancia problema. Es conveniente disponer de información adicional sobre el destino de la sustancia problema en el suelo, tal como las velocidades de degradación biótica y abiótica.
5.
Este método de ensayo puede utilizarse para sustancias tanto solubles como insolubles en agua. Sin embargo, el modo de aplicación de la sustancia problema variará en consecuencia. El método de ensayo no es aplicable a las sustancias volátiles, es decir, sustancias cuya constante de Henry o cuyo coeficiente de reparto aire/agua sea superior a uno, o sustancias cuya presión de vapor a 25 °C supere los 0,0133 Pa.
VALIDEZ DEL ENSAYO
6.
Para que el resultado de un ensayo se considere válido, deben cumplirse los siguientes criterios en lo tocante a los controles sin tratar:
—
La mortalidad media de las hembras adultas no debe ser superior al 20 % al final del ensayo;
—
El número medio de juveniles por réplica (con 10 hembras adultas introducidas) debe ser como mínimo de 50 al final del ensayo;
—
El coeficiente de variación calculado para el número de ácaros juveniles por réplica no debe ser superior al 30 % al final del ensayo definitivo.
SUSTANCIA DE REFERENCIA
7.
Debe determinarse la ECx y/o la NOEC de una sustancia de referencia para tener garantías de que las condiciones de ensayo del laboratorio son adecuadas y para verificar que la respuesta de los organismos de ensayo no cambia a lo largo del tiempo. El dimetoato (no CAS 60-51-5) es una sustancia de referencia apropiada que ha mostrado que afecta al tamaño de la población (4). El ácido bórico (no CAS 10043-35-3) puede utilizarse como sustancia de referencia alternativa. Con esta sustancia se tiene menos experiencia. Son posibles dos opciones de diseño:
—
La sustancia de referencia puede someterse a ensayo en paralelo a la determinación de la toxicidad de cada sustancia problema a una sola concentración, de la que se debe haber demostrado previamente, en un estudio de la relación dosis-respuesta, que provoca un efecto de reducción > 50 % de la descendencia. En este caso, el número de réplicas debe ser el mismo que en los controles (véase el punto 29).
—
Como alternativa, la sustancia de referencia se puede someter 1-2 veces al año a un ensayo de determinación de la relación dosis-respuesta. En función del diseño elegido, varían el número de concentraciones y réplicas y el factor de separación (véase el punto 29), pero debería lograrse una respuesta con un efecto de entre el 10 y el 90 % (factor de espaciado de 1,8). La EC50 del dimetoato basada en el número de juveniles debe oscilar entre 3,0 y 7,0 mg de sustancia activa /kg de suelo (peso seco). Sobre la base de los resultados obtenidos con ácido bórico hasta ahora, la EC50 basada en el número de juveniles debe estar en el intervalo comprendido entre 100 y 500 mg/kg de suelo (peso seco).
DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO
Recipientes y equipo del ensayo
8.
Deben usarse recipientes de ensayo de 3 a 5 cm de diámetro (altura del suelo ≥ 1,5 cm), de vidrio u otro material químicamente inerte y que tengan una tapa que ajuste bien. Se prefieren las tapas de rosca y, en ese caso, los recipientes podrían airearse dos veces por semana. Otra posibilidad consiste en utilizar tapas que permitan el intercambio gaseoso directo entre el sustrato y la atmósfera (por ejemplo, de gasa). Dado que el contenido de humedad debe mantenerse suficientemente alto durante el ensayo, es esencial controlar el peso de cada recipiente experimental durante el ensayo y añadir agua en caso necesario. Esto puede ser especialmente importante en caso de que no se disponga de tapas de rosca. Si se utiliza un recipiente de ensayo no transparente, la tapa debe estar hecha de un material que permita la entrada de luz (por ejemplo, una tapa transparente perforada) y que evite al mismo tiempo que se escapen los ácaros. El tamaño y el tipo de recipiente de ensayo dependen del método de extracción (véanse más detalles en el anexo 5). En el caso de que se aplique directamente al recipiente de ensayo la extracción por calor, puede añadirse un tamiz de fondo de luz de malla adecuada (sellada hasta la extracción), y la profundidad del suelo debe ser suficiente para permitir un gradiente de temperatura y de humedad.
9.
Se precisa el equipo normal de laboratorio y, en particular, el siguiente:
—
recipientes, preferentemente de vidrio, con tapa de rosca;
—
estufa secadora;
—
microscopio estereoscópico;
—
pinceles para transferir los ácaros;
—
pH-metro y luxómetro;
—
balanzas de precisión adecuada;
—
equipo adecuado para el control de la temperatura;
—
equipo adecuado para el control de la humedad del aire (no esencial si los recipientes de exposición tienen tapa);
—
incubadora o pequeña sala de temperatura controlada;
—
equipos de extracción (véase el apéndice 5) (13);
—
panel luminoso superior, con control de la luz;
—
tarros de recogida para los ácaros extraídos.
Preparación del suelo artificial
10.
Para este ensayo se utiliza suelo artificial. Este consta de los componentes siguientes (todos los valores en peso seco):
— 5 % de turba esfágnea, secada al aire y finamente molida (es aceptable un tamaño de partícula de 2 ± 1 mm);
— 20 % de caolín, con un contenido de caolinita preferentemente superior al 30 %;
— alrededor del 74 % de arena industrial secada al aire (dependiendo de la cantidad necesaria de CaCO3), en su mayor parte en forma de arena fina, con más del 50 % de las partículas de un tamaño entre 50 y 200 μm. La cantidad exacta de arena depende de la cantidad de CaCO3 (véase más abajo), juntas deben constituir el 75 %.
— < 1,0 % de carbonato de calcio (CaCO3, pulverizado, de pureza analítica) para obtener un pH de 6,0 ± 0,5; la cantidad de carbonato de calcio añadido puede depender principalmente de la calidad o naturaleza de la turba (véase la nota 1).
Nota 1: La cantidad necesaria de CaCO3 depende de los componentes del sustrato del suelo y debe determinarse midiendo el pH de submuestras del suelo inmediatamente antes de ensayo (14).
Nota 2: El contenido de turba del suelo artificial se aparta del de otros métodos de ensayo con organismos del suelo, en la mayoría de los cuales se utiliza un 10 % de turba [véase, p. ej., (15)]. Sin embargo, con arreglo a la OEPP (16), un suelo agrícola típico no tiene más de un 5 % de materia orgánica, y la reducción del contenido de turba refleja, pues, la disminución de las posibilidades de sorción de la sustancia problema al carbono orgánico en un suelo natural.
Nota 3: En caso necesario, por ejemplo con fines de ensayo específicos, pueden también servir como sustrato de ensayo o cultivo suelos naturales procedentes de lugares exentos de contaminación. No obstante, si se utiliza suelo natural, este debe caracterizarse al menos por su origen (lugar de recogida), pH, textura (granulometría) y contenido de materia orgánica. Si se dispone de ellos, deben incluirse el tipo y el nombre del suelo con arreglo a la clasificación del suelo, y el suelo ha de estar libre de toda contaminación. En caso de que la sustancia problema sea un metal o un compuesto organo-metálico, debe determinarse también la capacidad de intercambio catiónico (CEC) del suelo natural. Debe prestarse especial atención al cumplimiento de los criterios de validez, ya que no es frecuente disponer de información de base sobre los suelos naturales.
11.
Los componentes secos del suelo se mezclan a fondo (por ejemplo, en un mezclador de laboratorio de gran escala). Para la determinación del pH se utiliza una mezcla de suelo y solución de cloruro de potasio (KCl) 1 M o de cloruro de calcio (CaCl2) 0,01 M en una proporción de 1:5 [véanse la referencia (14) y el apéndice 3]. Si el suelo es más ácido que la banda exigida (véase el punto 10), puede ajustarse añadiendo una cantidad adecuada de CaCO3. Si el suelo es demasiado alcalino, puede ajustarse mediante la adición de más cantidad de la mezcla que incluye los tres primeros componentes descritos en el punto 10, pero excluyendo el CaCO3.
12.
La capacidad máxima de retención de agua del suelo artificial se determina de acuerdo con los procedimientos descritos en el apéndice 2. Entre dos y siete días antes del inicio del ensayo, el suelo artificial seco se prehumedece, añadiéndole una cantidad suficiente de agua destilada o desionizada para obtener aproximadamente la mitad del contenido final de agua, que supone de un 40 a un 60 % de la capacidad máxima de retención de agua. El contenido de humedad se ajusta al 40-60 % de la capacidad máxima de retención de agua mediante la adición de la solución de la sustancia problema y/o añadiendo agua desionizada o destilada (véanse los puntos 16 a 18). Debe obtenerse una estimación general adicional del contenido de humedad del suelo apretando este suavemente con la mano; si el contenido de humedad es correcto, deben aparecer gotitas de agua entre los dedos.
13.
Se determina el contenido de humedad del suelo al inicio y al final del ensayo, secándolo hasta peso constante a 105 °C, de conformidad con la norma ISO 11465 (17), y el pH del suelo de conformidad con el apéndice 3, o la norma ISO 10390 (14). Estas mediciones deben realizarse con muestras adicionales sin ácaros, tanto del suelo de los controles como del suelo de cada concentración de ensayo. El pH del suelo no debe ajustarse cuando se ensayen sustancias ácidas o básicas. El contenido de humedad debe comprobarse a lo largo de todo el ensayo pesando los recipientes de manera periódica (véanse los puntos 20 y 24).
Selección y preparación de los animales de ensayo
14.
La especie usada en el ensayo es Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer (Canestrini, 1883). Para iniciar el ensayo se requieren ácaros hembras adultos, obtenidos a partir de una cohorte sincronizada. Los ácaros deben introducirse a los 7-14 días después de haberse convertido en adultos, a los 28-35 días desde el inicio de la puesta de huevos en la sincronización (véanse el punto 3 y el apéndice 4). Debe indicarse la fuente de los ácaros o el proveedor, así como el mantenimiento del cultivo de laboratorio. Si se mantiene un cultivo de laboratorio, se recomienda confirmar la identidad de la especie al menos una vez al año. En el apéndice 6 se incluye una ficha de identificación.
Preparación de las concentraciones de ensayo
15.
La sustancia problema se mezcla con el suelo. Los disolventes orgánicos utilizados para facilitar el tratamiento del suelo con la sustancia problema deben seleccionarse sobre la base de su baja toxicidad para los ácaros y debe incluirse en el diseño del ensayo un control adecuado de los disolventes (véase el punto 29).
Sustancia problema hidrosoluble
16.
Se prepara una solución de la sustancia problema en agua desionizada en una cantidad suficiente para todas las réplicas de una sola concentración de ensayo. Se recomienda utilizar una cantidad apropiada de agua para conseguir el contenido necesario de humedad, es decir, entre el 40 y el 60 % de la capacidad máxima de retención de agua (véase el punto 12). Cada una de las soluciones de la sustancia problema se mezcla a fondo con un lote de suelo prehumedecido antes de introducirla en el recipiente de ensayo.
Sustancia problema no hidrosoluble
17.
En el caso de las sustancias no hidrosolubles en el agua, pero solubles en disolventes orgánicos, la sustancia problema puede disolverse en el volumen mínimo posible de un vehículo adecuado (por ejemplo, acetona). Solo deben utilizarse disolventes volátiles. Cuando se utilicen tales vehículos, todas las concentraciones de ensayo y el control deben contener la misma cantidad mínima del vehículo. El vehículo se rocía sobre una pequeña cantidad, como, por ejemplo, 10 g de arena de cuarzo fina, o se mezcla con ella. El contenido de arena total del sustrato debe corregirse para tener en cuenta esta cantidad. El vehículo se elimina por evaporación bajo una campana extractora durante al menos una hora. Esta mezcla de arena de cuarzo y sustancia problema se añade al suelo prehumedecido y se mezcla completamente, añadiendo la cantidad adecuada de agua desionizada para obtener la humedad necesaria. La mezcla final se introduce en los recipientes de ensayo. Obsérvese que algunos disolventes pueden ser tóxicos para los ácaros. Se recomienda, por tanto, utilizar un control de agua adicional sin vehículo, si no se conoce la toxicidad del disolvente para los ácaros. Si se demuestra adecuadamente que el disolvente (en las concentraciones que deben aplicarse) no tiene ningún efecto, puede excluirse el control de agua.
Sustancia problema poco soluble en agua y en disolventes orgánicos
18.
En el caso de sustancias poco solubles en agua y en disolventes orgánicos, se mezcla el equivalente de 2,5 g de arena de cuarzo finamente molida por recipiente de ensayo (por ejemplo, 10 g de arena de cuarzo fina para cuatro réplicas) con la cantidad de sustancia problema necesaria para obtener la concentración de ensayo deseada. El contenido de arena total del sustrato debe corregirse para tener en cuenta esta cantidad. Esta mezcla de arena de cuarzo y sustancia problema se añade al suelo prehumedecido y se mezcla completamente después de añadir la cantidad adecuada de agua desionizada para obtener el contenido necesario de humedad. La mezcla final se divide entre los recipientes de ensayo. Se repite el procedimiento con cada concentración de ensayo, y se prepara asimismo un control adecuado.
PROCEDIMIENTO
Grupos de ensayo y controles
19.
Se recomienda utilizar en cada recipiente de control y de tratamiento diez hembras adultas en 20 g de peso seco de suelo artificial. Los organismos de ensayo deben añadirse en el plazo de dos horas tras la preparación del sustrato de ensayo final (es decir, después de la aplicación de la sustancia problema). En casos específicos (por ejemplo, si el envejecimiento se considera un factor determinante), puede prolongarse el tiempo transcurrido entre la preparación del sustrato de ensayo final y la adición de los ácaros [para más detalles de este envejecimiento, véase (18)]. Sin embargo, en tales casos debe proporcionarse una justificación científica.
20.
Después de añadir los ácaros al suelo, se les aporta alimento y debe medirse el peso inicial de cada recipiente de ensayo, para utilizarlo de referencia en la supervisión del contenido de humedad del suelo a lo largo de todo el ensayo, como se describe en el punto 24. Los recipientes de ensayo se cubren entonces, como se describe en el punto 8, y se colocan en la cámara de ensayo.
21.
Se preparan controles adecuados para cada uno de los métodos de aplicación de la sustancia problema descritos en los puntos 15 a 18. Para preparar los controles se siguen los procedimientos pertinentes descritos, salvo que no se añade la sustancia problema. Por lo tanto, en su caso, se utilizan en los controles disolventes orgánicos, arena de cuarzo u otros vehículos, en concentraciones y cantidades como en los tratamientos. Cuando se utiliza un disolvente u otro vehículo para añadir la sustancia problema, debe prepararse y someterse a ensayo un control adicional sin sustancia problema y sin vehículo en caso de que no se conozca la toxicidad del disolvente (véase el punto 17).
Condiciones del ensayo
22.
La temperatura de ensayo debe ser de 20 ± 2 °C. La temperatura debe registrarse al menos una vez al día y ajustarse cuando sea necesario. El ensayo se efectúa en ciclos controlados de luz y oscuridad (preferentemente 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad) con una iluminación de 400 a 800 lux en la zona de los recipientes de ensayo. En aras de la comparabilidad, dichas condiciones son las mismas que en otros ensayos ecotoxicológicos del suelo [p. ej., (15)].
23.
Debe garantizarse el intercambio de gases por aireación de los recipientes de ensayo al menos dos veces por semana en caso de que se utilicen tapas de rosca. Si se utilizan tapas de gasa, deberá prestarse especial atención al mantenimiento del contenido de humedad del suelo (véanse los puntos 8 y 24).
24.
Se controla que el contenido de agua del sustrato del suelo en los recipientes de ensayo se mantenga constante a lo largo de todo el ensayo, pesando periódicamente (p. ej., una vez por semana) los recipientes de ensayo y, en caso necesario, añadiéndoles agua. Las pérdidas se compensan en la medida de lo necesario con agua desionizada. El contenido de humedad durante el ensayo no debe diferir en más de un 10 % del valor inicial.
Alimentación
25.
26.
Los alimentos deben aportarse ad libitum (pero cada vez una pequeña cantidad, como la punta de una espátula). A este fin, también puede utilizarse un extractor de baja succión como se propone en el ensayo con colémbolos o un pincel fino. Normalmente es suficiente aportar alimento al comienzo del ensayo y dos o tres veces por semana. Cuando resulte que la sustancia problema es tóxica para la presa, debe considerarse la posibilidad de aumentar la frecuencia de la alimentación, o de utilizar otra fuente.
Selección de las concentraciones de ensayo
27.
El conocimiento previo de la toxicidad de la sustancia problema debe ayudar a la hora de seleccionar las concentraciones de ensayo apropiadas, por ejemplo gracias a un estudio de determinación del intervalo. Cuando sea necesario, se llevará a cabo un ensayo de determinación del intervalo con cinco concentraciones de la sustancia problema en el intervalo de 0,1-1 000 mg/kg de suelo seco, con al menos una réplica de los tratamientos y del control. La duración de la prueba de determinación del intervalo es de 14 días, tras los cuales se determinan la mortalidad de los ácaros adultos y el número de juveniles. El intervalo de concentraciones para el ensayo final debe elegirse preferentemente de manera que incluya las concentraciones a las que se ve afectado el número de juveniles, pero no la supervivencia de la generación materna. Esto, sin embargo, puede no ser posible para las sustancias que provocan efectos letales y subletales a concentraciones casi similares. La concentración con efecto (por ejemplo, EC50, EC25, EC10) y el rango de concentraciones a las que resulta interesante el efecto de la sustancia problema tienen que estar abarcados entre las concentraciones incluidas en el ensayo. Extrapolar muy por debajo de la menor concentración que afecte a los organismos de ensayo o por encima de la mayor concentración estudiada debe limitarse a casos excepcionales, de los que deberá ofrecerse una explicación completa en el informe.
Diseño experimental
Ensayos de relación dosis-respuesta
28.
Se proponen tres diseños sobre la base de las recomendaciones derivadas de otra prueba interlaboratorios [ensayo de reproducción de enquitreidos (22)]. La conveniencia general de todos estos diseños fue confirmada por el resultado de la validación con H. aculeifer.
29.
Al determinar el intervalo de concentraciones, debe tenerse en cuenta lo siguiente:
— para la determinación de una ECx (p. ej., EC10, EC50), deben someterse a ensayo al menos doce concentraciones; se recomienda utilizar al menos dos réplicas de cada concentración de ensayo y seis réplicas de control; el factor de espaciado puede variar, es decir, ser igual o inferior a 1,8 en el intervalo de efecto previsto y superior a 1,8 a concentraciones superiores e inferiores;
— para la determinación de la NOEC deben someterse a ensayo al menos cinco concentraciones en serie geométrica; se recomienda utilizar cuatro réplicas de cada concentración de ensayo más ocho controles; las concentraciones deben estar espaciadas por un factor que no exceda de 2,0;
— un enfoque combinado permite la determinación tanto de la NOEC como de la ECx; deben utilizarse ocho concentraciones de tratamiento en progresión geométrica; se recomienda utilizar cuatro réplicas de cada tratamiento más ocho controles; las concentraciones deben estar espaciadas por un factor que no exceda de 1,8.
Ensayo límite
30.
Si no se observan efectos a la concentración máxima utilizada en el ensayo de determinación del intervalo (es decir, 1 000 mg/kg de peso seco de suelo), el ensayo definitivo de reproducción se puede realizar como ensayo límite, con una concentración de ensayo de 1 000 mg/kg de peso seco de suelo. El ensayo límite ofrecerá la oportunidad de demostrar que la NOEC o la EC10 para la reproducción es superior a la concentración límite, reduciendo al mínimo el número de ácaros utilizados en el ensayo. Deben utilizarse ocho réplicas tanto para el suelo tratado como para el control.
Duración del ensayo y mediciones
31.
Deben registrarse todas las eventuales diferencias observadas entre el comportamiento y la morfología de los ácaros en los recipientes de control y en los de tratamiento.
32.
El día 14, los ácaros supervivientes se extraen del suelo utilizando calor o luz, u otro método adecuado (véase el apéndice 5). Se cuentan por separado el número de juveniles (es decir, larvas, protoninfas y deutoninfas) y el de adultos. Los eventuales ácaros adultos que no se encuentren en esta fase se registrarán como muertos, suponiendo que tales ácaros han muerto y se han descompuesto antes de la evaluación. La eficacia de la extracción debe validarse una o dos veces al año mediante controles con números conocidos de adultos y de juveniles. La eficacia debe ser superior al 90 % por término medio, combinando todas las fases de desarrollo (véase el apéndice 5). Los recuentos de adultos y de juveniles no se ajustarán para tener en cuenta la eficacia.
DATOS E INFORME
Tratamiento de los resultados
33.
En los puntos 36 a 41 figura información sobre los métodos estadísticos que pueden utilizarse para analizar los resultados del ensayo. Además debe consultarse el documento 54 de la OCDE sobre Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (31).
34.
El parámetro principal del ensayo es el resultado reproductor, que aquí se refiere al número de juveniles producidos por recipiente de ensayo replicado (con 10 hembras adultas introducidas). El análisis estadístico requiere que se calculen la media aritmética (X) y la varianza (s2) del resultado reproductor por tratamiento y por control. X y s2 se utilizan en procedimientos de análisis de la varianza (ANOVA), tales como la prueba t de Student, el ensayo de Dunnett, o el ensayo de Williams, así como para el cálculo de los intervalos de confianza del 95 %.
Nota: Este parámetro principal es equivalente a la fecundidad medida como número de juveniles vivos producidos durante el ensayo, dividido por el número de madres introducidas al inicio del ensayo.
35.
El número de hembras supervivientes en los controles sin tratar es un importante criterio de validez y ha de documentarse. Como en el ensayo de determinación del intervalo, también deben registrarse en el informe final todos los demás signos de naturaleza nociva.
ECx
36.
Los valores de ECx, junto con sus correspondientes límites de confianza del 95 % inferior y superior para el parámetro descrito en el punto 34, se calculan utilizando métodos estadísticos apropiados (por ejemplo, análisis de probit, función logística o de Weibull, método de Spearman-Karber recortado o interpolación simple). Se obtiene una ECx insertando en la ecuación encontrada un valor correspondiente al x % de la media del control. Para calcular la EC50 o alguna otra ECx, las medias por tratamiento (X) deben someterse a análisis de regresión.
NOEC/LOEC
37.
Cuando se pretenda determinar la NOEC/NOEL mediante análisis estadístico, será necesario disponer de estadísticas por recipiente (se considera que cada uno de los recipientes es una réplica). Se deben utilizar métodos estadísticos apropiados según el documento 54 de la OCDE sobre Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application. En general, los efectos adversos de la sustancia problema en comparación con el control se investigan utilizando contrastes de hipótesis unilaterales (inferiores) a p ≤ 0,05. En los puntos siguientes se presentan ejemplos.
38.
La distribución normal de los datos puede comprobarse, por ejemplo, con la prueba de la bondad del ajuste de Kolmogorov-Smirnov, la prueba de la relación del intervalo a la desviación típica (prueba R/s), o la prueba de Shapiro-Wilk) (bilateral, p ≤ 0,05). Para comprobar la homogeneidad de la varianza pueden utilizarse las pruebas de Cochran, de Levene o de Bartlett (bilateral, p ≤ 0,05). Si se cumplen los requisitos previos de los procedimientos de ensayos paramétricos (normalidad, homogeneidad de la varianza) puede efectuarse un análisis de la varianza (ANOVA) de un factor, seguido de pruebas de comparación múltiple. Las comparaciones múltiples (por ejemplo, prueba t de Dunnett) o las pruebas de tendencia de ajuste secuencial (p. ej., prueba de Williams en el caso de una relación dosis-respuesta monótona) pueden utilizarse para determinar si existen diferencias significativas (p ≤ 0,05) entre los controles y las diversas concentraciones de la sustancia problema (selección del ensayo recomendado de acuerdo con el documento 54 de la OCDE sobre Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application). De lo contrario, para determinar la NOEC y la LOEC deben utilizarse métodos no paramétricos (p. ej., prueba U de Bonferroni según Holm o prueba de tendencia de Jonckheere-Terpstra).
Ensayo límite
39.
Si se realiza un ensayo límite (comparación del control y de un solo un tratamiento) y se cumplen los requisitos previos de procedimientos de ensayos paramétricos (normalidad, homogeneidad), pueden evaluarse las respuestas métricas con la prueba de Student (prueba t). Si estos requisitos no se satisfacen, puede utilizarse la prueba t de varianzas desiguales (prueba t de Welch) o una prueba no paramétrica, tal como la prueba U de Mann-Whitney.
40.
Para determinar la existencia de diferencias significativas entre los controles (control y control del disolvente), las réplicas de cada control pueden someterse a ensayo según lo descrito para el ensayo límite. En caso de que tales ensayos no detecten diferencias significativas, pueden agruparse todas las réplicas de control y de control del disolvente. En caso contrario, todos los tratamientos deben compararse con el control del disolvente.
Informe del ensayo
41.
El informe del ensayo debe incluir al menos la información siguiente:
— Sustancia problema
— identidad de la sustancia problema, nombre, lote de fabricación, lote de acondicionamiento y número CAS, pureza;
— propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema [por ejemplo, log Kow, hidrosolubilidad, presión de vapor, constante de Henry (H) y de preferencia información sobre el destino de la sustancia problema en el suelo].
— Organismos de ensayo
— identificación y proveedor de los organismos de ensayo, descripción de las condiciones de cultivo;
— intervalo de edad de los organismos de ensayo.
— Condiciones del ensayo
— descripción del diseño experimental y del procedimiento;
— datos de la preparación del suelo para el ensayo; especificación detallada de si se utiliza suelo natural (origen, historia, granulometría, pH, contenido de materia orgánica y, si se dispone de ella, clasificación del suelo);
— capacidad máxima de retención de agua del suelo;
— descripción de la técnica utilizada para aplicar la sustancia problema al suelo;
— datos de las sustancias auxiliares utilizadas para la administración de la sustancia problema;
— tamaño de los recipientes de ensayo y peso seco de suelo de ensayo por recipiente;
— condiciones del ensayo: intensidad luminosa, duración de los ciclos de luz y oscuridad, temperatura;
— descripción del régimen alimentario, tipo y cantidad del alimento utilizado en el ensayo, fechas de alimentación;
— pH y contenido de agua del suelo al inicio del ensayo y durante el mismo (control y cada tratamiento);
— descripción detallada del método de extracción y eficacia de la extracción.
— Resultados del ensayo
— número de juveniles determinado en cada recipiente de ensayo al final del ensayo;
— número de hembras adultas y mortalidad de adultos ( %) determinados en cada recipiente de ensayo al final del ensayo;
— descripción de los síntomas manifiestos o de los cambios claros de comportamiento;
— resultados obtenidos con la sustancia de referencia;
— estadísticas resumidas (CEx y/o NOEC) incluidos los límites de confianza del 95 % y descripción del método de cálculo;
— representación gráfica de la relación concentración-respuesta;
— eventuales desviaciones respecto a los procedimientos descritos en el presente método de ensayo y cualquier acontecimiento inusual ocurrido en el ensayo.
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(15)
Capítulo C.8 del presente anexo. Toxicidad para gusanos de tierra.
(16)
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(20)
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(22)
Capítulo C.32 del presente anexo. Ensayo de reproducción de enquitreidos.
(23)
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Apéndice 1
Definiciones
En este método de ensayo se aplican las siguientes definiciones (en este ensayo todas las concentraciones con efecto se expresan en masa de sustancia problema por masa seca del suelo de ensayo):
Sustancia : sustancia o mezcla.
NOEC (concentración sin efecto observado): concentración de la sustancia problema a la que no se observa ningún efecto. En este ensayo, la concentración correspondiente a la NOEC no ejerce ningún efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro de un determinado período de exposición en comparación con el control.
LOEC (concentración mínima con efecto observado): concentración mínima de la sustancia problema que tiene un efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro de un determinado período de exposición en comparación con el control.
ECx (concentración con efecto al x %): concentración que provoca el x % de un efecto sobre los organismos de ensayo dentro de un determinado período de exposición cuando se compara con un control. Por ejemplo, una EC50 es una concentración de la que se estima que causa un efecto sobre un parámetro de un ensayo en el 50 % de una población expuesta a lo largo de un determinado período de exposición.
Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.
Apéndice 2
Determinación de la capacidad máxima de retención de agua del suelo
Se considera que el siguiente método es adecuado para determinar la capacidad máxima de retención de agua del suelo. Se describe en el anexo C de la norma ISO DIS 11268-2: Calidad del suelo. Efectos de los contaminantes en lombrices (Eisenia fetida). Parte 2: Determinación de los efectos en la reproducción (23).
Se recoge una determinada cantidad (p. ej., 5 g) del sustrato de suelo de ensayo, utilizando un dispositivo adecuado de muestreo (tubo de barrena, etc.). Se cubre el fondo del tubo con un trozo de papel de filtro impregnado de agua y se coloca a continuación en un soporte en un baño de agua. El tubo debe sumergirse gradualmente hasta que el nivel del agua esté por encima del extremo superior del suelo. A continuación, se debe dejar en el agua alrededor de tres horas. Dado que no puede retenerse toda el agua absorbida por los capilares del suelo, la muestra de suelo debe dejarse escurrir durante un período de dos horas, colocando el tubo en un lecho de arena de cuarzo finamente molida muy húmeda y contenida en un recipiente tapado (para evitar que se seque). Después, la muestra debe pesarse y secarse hasta obtener una masa constante a 105 °C. La capacidad de retención de agua (WHC) puede calcularse entonces de la manera siguiente:
Formula
donde:
S= masa del sustrato saturado de agua + masa del tubo + masa del papel de filtro
T= tara (masa del tubo + masa del papel de filtro)
D= masa seca del sustrato
Apéndice 3
Determinación del pH del suelo
El siguiente método de determinación del pH de un suelo se basa en la descripción recogida en la norma ISO DIS 10390: Calidad del suelo. Determinación del pH (16).
Una determinada cantidad de suelo se seca a temperatura ambiente durante al menos 12 horas. A continuación se hace una suspensión del suelo (con al menos 5 gramos de este) en cinco veces su volumen de una solución 1 M de cloruro de potasio de grado analítico (KCl) o de una solución 0,01 M de cloruro de calcio de grado analítico (CaCl2). Después de agitarla enérgicamente durante 5 minutos, se deja reposar la suspensión desde 2 horas como mínimo hasta 24 horas como máximo. El pH de la fase líquida se mide a continuación utilizando un pH-metro, que habrá sido calibrado antes de cada medición con una serie adecuada de soluciones amortiguadoras (p. ej., a un pH de 4,0 y 7,0).
Apéndice 4
Cría de Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer, ácaros de alimento y sincronización del cultivo
Cría de Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer:
Los cultivos pueden mantenerse en recipientes de plástico o en tarros de vidrio rellenos de una mezcla de yeso y carbón vegetal en polvo, en la proporción 9:1. El yeso puede mantenerse húmedo añadiendo unas gotas de agua destilada o desionizada, en caso necesario. Las temperaturas óptimas de cría son de 20 ± 2 °C; el régimen de luz/oscuridad no es pertinente para esta especie. Las presas pueden ser ácaros de las especies Typrophagus putrescentiae o Caloglyphus sp. (los ácaros de alimento deben tratarse con prudencia ya que pueden provocar alergias en los seres humanos), pero los nematodos, los enquitreidos y los colémbolos también pueden ser adecuados como presa. Su origen debe registrarse. El desarrollo de la población puede empezar con una sola hembra porque los machos se forman en huevos sin fecundar. Las generaciones se solapan en gran medida. Una hembra puede vivir al menos 100 días y puede depositar aproximadamente 100 huevos durante su vida. La tasa máxima de puesta de huevos la alcanzan entre los días 10 y 40 (tras hacerse adultas) y supone 2,2 huevos hembra– 1 día– 1. El tiempo de desarrollo desde la fase de huevo a la de hembra adulta es de unos 20 días a 20 °C. Deben mantenerse y tratarse varios cultivos previamente.
Cría de Typrophagus putrescentiae:
Los ácaros se mantienen en un recipiente de vidrio relleno de polvo fino de levadura de cerveza, que se pone en un cubo de plástico lleno de solución de KNO3, a fin de impedir que se escapen los animales. Los ácaros de alimento se colocan encima de este polvo. Después, se mezclan cuidadosamente con el polvo (que ha de sustituirse dos veces por semana) con ayuda de una espátula.
Sincronización del cultivo:
Los especímenes que se utilicen en el ensayo deben ser de edad similar (de unos 7 días tras alcanzar la fase de adultos). A una temperatura de cría de 20 °C, esto se efectúa de la manera siguiente:
Se transfieren hembras a un recipiente de cría limpio y se añade suficiente alimento.
—Tras dejar dos o tres días para que puedan poner huevos, se retiran las hembras.
—Se toman hembras adultas para el ensayo cuando han pasado entre 28 y 35 días desde la fecha de inicio de la transferencia de las hembras a los recipientes de cría limpios.
Las hembras adultas pueden distinguirse con facilidad de los machos y de otras fases del desarrollo por su mayor tamaño, su forma inflada y su escudo dorsal marrón (los machos son más delgados y planos), y los juveniles son de color blanco a crema. El desarrollo de los ácaros sigue aproximadamente la pauta descrita a continuación a 20 °C (véase la figura): huevo 5 días, larva 2 días, protoninfa 5 días, deutoninfa 7 días, período previo a la puesta de huevos por la hembra 2 días. A partir de ese momento, los ácaros son adultos.
Figura
Desarrollo de Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer a 20 °C (retirada = hembras utilizadas para el ensayo).
IMAGEN OMITIDA
Los animales de ensayo adultos se retiran del cultivo sincronizado y se introducen en los recipientes de ensayo cuando han pasado entre 28 y 35 días desde el momento en que las madres empezaron a poner huevos (es decir, 7-14 días desde que se han convertido en adultos). De esta manera se garantiza que los animales de ensayo han superado su período previo a la puesta de huevos y se han apareado con machos que también están presentes en el recipiente de cultivo. Según se deduce de observaciones efectuadas en cultivos de laboratorio, las hembras se aparean inmediatamente o poco después de convertirse en adultos si hay machos presentes (Ruf, Vaninnen, obs. pers.). El período de siete días se ha elegido para facilitar la integración en el trabajo del laboratorio y para amortiguar las diferencias de desarrollo individual de los ácaros. La puesta de huevos debe iniciarse con al menos el mismo número de hembras que se vaya a necesitar al final para el ensayo (si, por ejemplo, se van a necesitar 400 hembras para el ensayo, debe permitirse que pongan huevos al menos 400 hembras durante dos o tres días). El punto de partida para la población sincronizada deben ser al menos 1 200 huevos (la proporción de machos y hembras debe estar cerca de 1:1, y la mortalidad próxima a 0,2). Para evitar el canibalismo, es más práctico no mantener más de 20-30 hembras ponedoras de huevos en un mismo recipiente.
Apéndice 5
Métodos de extracción
Para los microartrópodos, la extracción por calor es un método adecuado para separar los especímenes del suelo o sustrato (véase la figura a continuación). El método se basa en la actividad de los organismos, por lo que solo podrán registrarse los especímenes móviles. El principio de la extracción por calor es ir empeorando gradualmente las condiciones que ofrece la muestra a los organismos, a fin de que estos abandonen el sustrato y caigan a un líquido de fijación (por ejemplo, etanol). Los puntos cruciales son la duración de la extracción y el gradiente de condiciones para los organismos, de buenas a moderadas y de moderadas a malas. La duración de la extracción para realizar ensayos ecotoxicológicos tiene que ser lo más breve posible, ya que un eventual crecimiento de la población durante la fase de extracción podría falsear los resultados. Por otra parte, las condiciones de temperatura y humedad de la muestra han de estar siempre en un intervalo que permita a los ácaros moverse. El calentamiento de la muestra de suelo lleva a la desecación del sustrato. Si la desecación es demasiado rápida, algunos ácaros podrían desecarse también antes de conseguir escapar.
Por lo tanto, se propone el siguiente procedimiento (24) (25):
Aparato: Embudo Tullgren o métodos comparables como, por ejemplo, el de McFadyen (calentamiento desde arriba, la muestra se pone sobre un embudo).
Régimen de calefacción: 25 °C durante 12 h, 35 °C durante 12 h, 45 oC durante 24 horas (en total, 48 h). La temperatura debe medirse en el sustrato.
Líquido de fijación: etanol al 70 %.
Detalles: Tomar el frasco de vidrio utilizado para el ensayo. Retirar la tapa y cubrir la boca con un trozo de malla o de tela. La tela utilizada debe tener una luz de malla de 1,0 a 1,5 mm; se fija con una goma elástica. Con cuidado se pone boca abajo el frasco y se introduce en el aparato de extracción. La tela impide que el sustrato caiga al líquido de fijación, pero permite que los ácaros salgan de la muestra. Se pone en marcha el régimen de calefacción después de haber introducido todos los frascos. Se finaliza la extracción a las 48 horas. Se retiran los frascos de fijación y se efectúa el recuento de los ácaros por medio de un microscopio de disección.
La eficacia de extracción del método elegido debe haberse demostrado una o dos veces al año con recipientes que contengan un número conocido de ácaros juveniles y de adultos en sustrato de ensayo sin tratar. La eficacia debe ser ≥ 90 % por término medio, combinando todas las fases de desarrollo.
Dispositivo de extracción tipo Tullgren
Image
Cómo preparar el frasco de ensayo una vez terminado el ensayo, antes de la extracción Image
Apéndice 6
Identificación de Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer
Subclase/orden/suborden:
Familia:
Género/subgénero/especie:
Acari/Parasitiformes/Gamasida
Laelapidae
Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer
Autor y fecha:
F. Faraji, Ph.D. (MITOX), 23 de enero de 2007
Bibliografía utilizada
Karg, W. (1993). Die freilebenden Gamasina (Gamasides), Raubmilben. Tierwelt Deutschlands 59, 2a edición revisada: 1-523.
Hughes, A.M. (1976). The mites of stored food and houses. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Technical Bulletin 9: 400 pp.
Krantz, G.W. (1978). A manual of Acarology. Oregon State University Book Stores, Inc., 509 pp.
Características determinantes:
Rostro con borde denticulado redondeado; surcos del hipostoma con más de 6 dentículos; sedas dorsales caudales Z4 no muy largas; sedas dorsales setiformes; escudo genital normal, no muy agrandado y sin alcanzar el escudo anal; mitad posterior del escudo dorsal sin sedas desemparejadas; patas II y IV con algunas macrosedas gruesas; seda dorsal Z5 unas dos veces más larga que la J5; dedo fijo de los quelíceros con 12-14 dientes y dedo móvil con 2 dientes; idiosoma 520-685 μm de largo.
La especie Hypoaspis miles también se utiliza en la lucha biológica y podría confundirse con H. aculeifer. La principal diferencia es la siguiente:
H. miles pertenece al subgénero Cosmolaelaps y tiene sedas dorsales en forma de cuchilla, mientras que H. aculeifer pertenece al subgénero Geolaelaps y tiene sedas dorsales setiformes.
IMAGEN OMITIDA
Apéndice 7
Información básica sobre la biología de Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer
La especie Hypoaspis aculeifer pertenece a la familia Lealapidae, orden Acari (ácaros), clase Arachnida, tribu Arthropoda. Vive en todos los tipos de suelo y se alimenta de otros ácaros, nematodos, enquitreidos y colémbolos (26). En caso de escasez de alimento se hacen caníbales (27). Los ácaros predadores están segmentados en idiosoma y gnatosoma. No hay una diferenciación clara del idiosoma en prosoma (cabeza) y opistosoma (abdomen). El gnatosoma (escudo capitular) contiene las piezas para la alimentación, como son los palpos y quelíceros. Los quelíceros están trifurcados y provistos de dientes de forma distinta. Además de para alimentarse, los machos utilizan los quelíceros principalmente para transferir los espermatóforos a las hembras. El idiosoma está cubierto casi completamente por un escudo dorsal. Una gran parte del idiosoma de las hembras está ocupada por los órganos reproductores, que destacan en particular poco antes de la puesta de huevos. Ventralmente se encuentran dos escudos, el esternal y el genital. Todas las patas están provistas de cerdas y espinas. Las cerdas se utilizan para sujetarse cuando se desplazan en el interior o en la superficie del suelo. El primer par de patas se utiliza principalmente como antenas. El segundo par de patas se utiliza no solo para el movimiento, sino también para agarrar la presa. Las espinas del cuarto par de patas pueden servir de protección así como de “motor de desplazamiento” (28). Los machos tienen 0,55-0,65 mm de longitud y un peso de 10-15 μg. Las hembras tienen 0,8-0,9 mm de longitud y un peso de 50-60 μg (8) (28) (figura 1).
Figura 1.
Hembra, macho, protoninfa y larva de H. aculeifer.
Image
A 23 °C, los ácaros maduran sexualmente a los 16 días (hembras) y 18 días (machos), respectivamente (6). Las hembras portan el esperma por el solenostoma, de donde se transfiere a continuación al ovario. En el ovario el esperma madura y se conserva. La fertilización se realiza únicamente después de la maduración del esperma en el ovario. Los huevos fecundados y sin fecundar son depositados por las hembras en agregados o por separado, de preferencia en cavidades o agujeros. Las hembras que se han apareado pueden producir juveniles de ambos sexos, mientras que de los huevos de hembras que no se han apareado solo salen juveniles machos. Durante el desarrollo se pasa por cuatro fases hasta llegar a la etapa de adulto (huevo — larva, larva — protoninfa, protoninfa — deutoninfa, deutoninfa — adulto).
El huevo es de color blanco lechoso, hialino, elíptico y de unos 0,37 mm de longitud, con una cubierta sólida. Según (8), las larvas tienen un tamaño entre 0,42 y 0,45 mm. Solo tienen tres pares de patas. En la región de la cabeza se desarrollan palpos y quelíceros. Los quelíceros, que tienen unos cuantos dentículos, se utilizan para la eclosión de los huevos. Tras la primera muda, 1-2 días después de la eclosión, se desarrollan las protoninfas. También son de color blanco, tienen un tamaño de 0,45-0,62 mm (8) y cuatro pares de patas. En los quelíceros están totalmente presentes los dientes. A partir de esta fase, los ácaros empiezan a buscar comida. Con este fin, la cutícula de las presas se perfora con los quelíceros y se introduce en la presa una secreción para la digestión extraintestinal. El ácaro puede entonces aspirar la masa alimentaria. Los quelíceros pueden también utilizarse para arrancar partículas mayores de pepitas alimentarias (28). Tras una nueva muda se forman las deutoninfas. Tienen un tamaño de 0,60-0,80 mm (8) y son de color amarillo a marrón claro. A partir de esta fase pueden distinguirse las hembras y los machos. Tras una nueva muda, durante la cual los animales están inactivos y se forma el escudo marrón (aproximadamente después de 14 días), los ácaros son adultos (28) (29) (30). La duración de su vida está entre 48 y 100 días a 25 °C (27).
Apéndice 8
Resumen Y calendario de las principales acciones que deben emprenderse a fin de realizar el ensayo con Hypoaspis
Tiempo (días)
Inicio del ensayo = día 0
Actividad/tarea
Día – 35
a día – 28
Transferencia de las hembras a partir del cultivo madre a recipientes limpios para iniciar la sincronización
Dos días después: extracción de las hembras
Dos o tres veces por semana: aporte de alimento suficiente
Día -5 (+/– 2)
Preparación del suelo artificial
Día -4 (+/– 2)
Determinación de la WHC del suelo artificial
Secado durante una noche
Día siguiente: Pesada de muestras y cálculo de la WHC
Día – 4 (+/– 2)
Prehumidificación del suelo artificial para alcanzar entre el 20 y el 30 % de la WHC
Día 0
Inicio del ensayo: adición de la sustancia problema al suelo artificial
Introducción de 10 hembras en cada réplica
Pesada de cada réplica
Establecimiento de controles abióticos para determinar el grado de humedad y el pH, dos réplicas por cada tratamiento
Secado de los controles de humedad durante una noche
Día siguiente: pesada de los controles de humedad
Día siguiente: medición del pH de los controles abióticos secados
Días 3, 6, 9, 12 (aprox.)
Aporte de la suficiente cantidad de organismos de presa a cada réplica
Pesada de cada réplica y adición eventual de la cantidad de agua evaporada
Día 14
Finalización del ensayo, inicio de la extracción de todas las réplicas y de los controles de eficacia de la extracción
Secado del contenido de agua de los controles durante una noche
Día siguiente: pesada del contenido de agua de los controles
Día siguiente: medición del pH de los controles secados
Día 16
Finalización de la extracción
Día 16 +
Registro del número de adultos y de juveniles en el material extraído
Informe de los resultados en los cuadros del modelo
Informe del procedimiento de ensayo en las fichas del protocolo del ensayo
C.37. ENSAYO DE VEINTIÚN DÍAS EN PECES: CRIBADO A CORTO PLAZO DE LA ACTIVIDAD ESTROGÉNICA Y ANDROGÉNICA Y DE LA INHIBICIÓN DE LA AROMATASA
INTRODUCCIÓN
1.
El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo (TG) 230 de la OCDE (2009). La necesidad de desarrollar y validar un ensayo en peces capaz de detectar determinadas sustancias con actividad endocrina radica en la preocupación de que los niveles medioambientales de sustancias puedan provocar efectos adversos tanto en los seres humanos como en la vida silvestre, debido a la interacción de dichas sustancias con el sistema endocrino. En 1998, la OCDE promovió una actuación de alta prioridad orientada a revisar las directrices existentes, así como a desarrollar otras nuevas para la selección y la evaluación de los alteradores endocrinos potenciales. Una faceta de esta actuación consistió en elaborar las directrices del ensayo para el cribado de sustancias activas sobre el sistema endocrino de especies de peces. El ensayo de cribado endocrino de veintiún días en peces se ha sometido a un amplio programa de validación, el cual consiste en varios estudios interlaboratorios con sustancias seleccionadas con el objeto de demostrar la pertinencia y la fiabilidad del ensayo en términos de detección de sustancias estrogénicas e inhibidoras de la aromatasa (1, 2, 3, 4, 5) en las tres especies de peces en estudio (el pez cabeza gorda, el medaka y el pez cebra). La detección de actividad androgénica es posible en el pez cabeza gorda y en el medaka, pero no en el pez cebra. El presente método de ensayo no permite la detección de sustancias antiandrogénicas. El trabajo de validación ha sido revisado por un grupo de expertos designados por los Coordinadores Nacionales del Programa de Directrices de Ensayo (6). El ensayo no se ha diseñado para identificar mecanismos específicos de alteración hormonal, ya que los animales del ensayo poseen un eje hipotálamo-hipófisis-gónadas (HPG) intacto, que puede responder a las sustancias que afectan a dicho eje en diferentes niveles. El ensayo sobre reproducción de peces a corto plazo (TG 229 de la OCDE) incluye la fecundidad y, en su caso, la histopatología gonadal del pez cabeza gorda, así como todos los parámetros incluidos en el presente método de ensayo. Las TG 229 de la OCDE ofrecen un cribado de las sustancias que afectan a la reproducción mediante diversos mecanismos, incluidas las modalidades endocrinas. Este factor debe tenerse en cuenta antes de seleccionar el método de ensayo más adecuado.
2.
El presente método de análisis describe un ensayo de cribado in vivo en el que peces macho sexualmente maduros y peces hembra que están desovando se mantienen en una misma ubicación y se exponen a una sustancia durante una parte limitada de su ciclo de vida (veintiún días). Al término del periodo de exposición de veintiún días, dependiendo de la especie utilizada, se miden uno o dos parámetros biomarcadores en machos y hembras que sirvan de indicadores de la inhibición de la aromatasa, de la actividad estrogénica o de la actividad androgénica de la sustancia problema. Estos parámetros son la vitelogenina (VTG) y caracteres sexuales secundarios. La vitelogenina se mide en el pez cabeza gorda, el medaka y el pez cebra, mientras que los caracteres sexuales secundarios se miden únicamente en el pez cabeza gorda y el medaka.
3.
Este bioensayo sirve de ensayo de cribado in vivo en relación con determinados mecanismos de acción endocrinos y su aplicación debe considerarse en el contexto del “OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” (Marco teórico para el estudio y la evaluación de los alteradores endocrinos de la OCDE) (28).
CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES
4.
La vitelogenina se produce normalmente en el hígado de los vertebrados ovíparos hembra como respuesta a los estrógenos endógenos circulantes. Es un precursor de las proteínas de la yema de huevo y, una vez que se produce en el hígado, viaja a través del torrente sanguíneo hasta el ovario, donde los huevos en desarrollo la absorben y modifican. La vitelogenina apenas se detecta en el plasma de los peces hembra inmaduros y de los machos porque no tienen suficientes estrógenos en circulación; no obstante, el hígado puede sintetizar y secretar vitelogenina como respuesta a la estimulación estrogénica exógena.
5.
La medición de la vitelogenina sirve para detectar sustancias con distintos mecanismos de acción estrogénica. La detección de sustancias estrogénicas es posible gracias a la medición de la inducción de la vitelogenina en los peces macho, lo cual ha quedado suficientemente documentado en los estudios revisados por expertos científicos [por ejemplo, (7)]. La inducción de la vitelogenina también ha quedado demostrada tras la exposición a andrógenos aromatizables (8, 9). Una reducción del nivel circulante de estrógenos en las hembras, por ejemplo, mediante la inhibición de la aromatasa que convierte el andrógeno endógeno en el estrógeno natural 17β-estradiol, provoca una disminución del nivel de vitelogenina, lo cual se utiliza para detectar sustancias con propiedades inhibidoras de la aromatasa (10, 11). La relevancia biológica de la respuesta de la vitelogenina tras la inhibición de estrógenos o de la aromatasa ha quedado establecida y se ha documentado ampliamente. Sin embargo, es posible que la producción de VTG en las hembras también pueda verse afectada por la toxicidad general y por mecanismos de acción tóxicos no endocrinos como, por ejemplo, la hepatotoxicidad.
6.
Se han logrado desarrollar varios métodos de medición de manera satisfactoria al tiempo que se han armonizado para el uso rutinario. Este es el caso de los métodos de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) específicos para cada especie, que usan la inmunoquímica para la cuantificación de la vitelogenina producida en pequeñas muestras sanguíneas o hepáticas recogidas en distintos peces (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Se recogen muestras sanguíneas de pez cabeza gorda, homogeneizados de cabeza/cola o muestras sanguíneas de pez cebra y muestras hepáticas de medaka para medir la VTG. En el caso del medaka existe una buena correlación entre la VTG medida en la sangre y en el hígado (19). En el apéndice 6 se recogen los procedimientos recomendados para la recogida de muestras para el análisis de la vitelogenina. Hay una gran variedad de juegos de medición de la vitelogenina, los cuales deben basarse en un método ELISA específico para cada especie.
7.
Los caracteres sexuales secundarios de los peces macho de determinadas especies son cuantificables y visibles externamente, además de responder a los niveles circulantes de andrógenos endógenos; este es el caso del pez cabeza gorda y del medaka, pero no así del pez cebra, que no posee caracteres sexuales secundarios cuantificables. Las hembras conservan la capacidad de desarrollar caracteres sexuales secundarios masculinos tras su exposición a sustancias androgénicas en el agua. Hay varios estudios disponibles en la bibliografía científica que documentan este tipo de respuesta en el pez cabeza gorda (20) y el medaka (21). Una disminución de los caracteres sexuales secundarios en los machos debería interpretarse con cautela debido a la baja potencia estadística y debe basarse en opiniones de expertos y en la ponderación de las pruebas. Dada la ausencia de caracteres sexuales secundarios cuantificables que respondan a las sustancias con acción androgénica, hay limitaciones en el uso del pez cebra en este ensayo.
8.
En el pez cabeza gorda, el principal indicador de exposición androgénica exógena es el número de tubérculos nupciales ubicados en el hocico del pez hembra. En el medaka, el número de tubérculos papilares constituye el principal marcador de exposición exógena a sustancias androgénicas en las hembras. El apéndice 5A y el apéndice 5B presentan los procedimientos recomendados para la evaluación de los caracteres sexuales en el pez cabeza gorda y el medaka, respectivamente.
9.
Las definiciones utilizadas en el presente método se recogen en el apéndice 1.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
10.
En el ensayo, se exponen juntos en recipientes de ensayo peces macho y hembra con capacidad reproductora. Su edad adulta y capacidad reproductora permite diferenciar claramente cada sexo y, por lo tanto, permite realizar un análisis de cada parámetro en relación con el sexo y garantiza su sensibilidad con respecto a las sustancias exógenas. Al finalizar el ensayo, el sexo se confirma con un examen macroscópico de las gónadas tras la apertura ventral del abdomen con unas tijeras. En el apéndice 2 se incluye un resumen de las condiciones relevantes del bioensayo. El ensayo comienza normalmente con muestras de peces de una población en periodo de desove. No deben utilizarse animales senescentes. En la sección dedicada a la selección de los peces se incluyen pautas relativas a la edad de los peces y su capacidad reproductora. El ensayo se realiza con tres concentraciones de exposición a la sustancia, así como con un control del agua y, en caso necesario, un control del disolvente. Se utilizan dos recipientes o réplicas por tratamiento (cada recipiente contiene cinco machos y cinco hembras) con medaka y pez cebra, mientras que con el pez cabeza gorda se utilizan cuatro recipientes o réplicas por tratamiento (cada recipiente contiene dos machos y cuatro hembras). Esta distribución sirve para adaptarse al comportamiento territorial del pez cabeza gorda macho a la vez que mantiene una potencia suficiente del ensayo. La exposición se lleva a cabo durante veintiún días y el muestreo de peces se lleva a cabo en el vigesimoprimer día de exposición.
11.
Cuando se realiza el muestreo el vigesimoprimer día, todos los animales son sacrificados de forma compasiva. Se miden los caracteres sexuales secundarios en el pez cabeza gorda y el medaka (véanse el apéndice 5A y el apéndice 5B); se recogen muestras de sangre para determinar la vitelogenina en el pez cebra y el pez cabeza gorda; también se pueden recoger muestras de la cabeza o cola para determinar la vitelogenina en el pez cebra (apéndice 6), además de recoger muestras hepáticas en el medaka para analizar la VTG (apéndice 6).
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN DEL ENSAYO
12.
Para que los resultados del ensayo sean aceptables, deben cumplirse las condiciones siguientes:
—la mortalidad en los controles del agua (o de disolvente) no ha de superar el 10 % al final del ensayo;