LA COMISION DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea ,

Vista la Directiva 70/373/CEE del Consejo de 20 de julio de 1970 relativa a la introducción de modos de toma de muestras y de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales (1) , modificada en último lugar por el Acta de adhesión de Grecia , y , en particular , su artículo 2 ,

Considerando que la Directiva citada prevé que los controles oficiales de los alimentos para animales destinados a comprobar que se respetan las condiciones establecidas en virtud de las disposiciones legales , reglamentarias o administrativas relativas a la calidad y a la composición de los alimentos para animales se efectuarán según los modos de toma de muestras y los métodos de análisis comunitarios ;

Considerando que las Directivas 71/250/CEE (2) , 73/46/CEE (3) , 74/203/CEE (4) , 75/84/CEE (5) , 76/372/CEE (6) de la Comisión , modificadas en último lugar por la Directiva 91/680/CEE (7) , las Directivas 71/393/CEE (8) , 72/199/CEE (9) , 78/633/CEE (10) , modificadas en último lugar por la Directiva 84/4/CEE (11) , así como por la Directiva 81/715/CEE (12) , han fijado ya determinados métodos de análisis comunitarios ; que , teniendo en cuenta el estado de los trabajos efectuados desde entonces , es conveniente adoptar un nuevo método ;

Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva se ajustan al dictamen del Comité permanente de la alimentación animal ,

HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :

Artículo 1

Los Estados miembros dispondrán que los análisis previstos para los controles oficiales de los alimentos para animales , en lo que se refiere a su contenido en espiramicina , se efectúen según el método descrito en el Anexo .

Artículo 2

Los Estados miembros aplicarán las disposiciones legales , reglamentarias y

administrativas necesarias para cumplir las disposiciones de la presente Directiva a más tardar el 30 de junio de 1985 , e informarán de ello a la Comisión .

Artículo 3

Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros .

Hecho en Bruselas , el 25 de julio de 1984 .

Por la Comisión

Poul DALSAGER

Miembro de la Comisión

(1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .

(2) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .

(3) DO n º L 83 de 30 . 3 . 1973 , p. 21 .

(4) DO n º L 108 de 22 . 4 . 1974 , p. 7 .

(5) DO n º L 32 de 5 . 2 . 1975 , p. 26 .

(6) DO n º L 102 de 15 . 4 . 1976 , p. 8 .

(7) DO n º L 246 de 29 . 8 . 1981 , p. 32 .

(8) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .

(9) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .

(10) DO n º L 206 de 29 . 7 . 1978 , p. 43 .

(11) DO n º L 15 de 18 . 1 . 1984 , p. 28 .

(12) DO n º L 257 de 10 . 9 . 1981 , p. 38 .

ANEXO

DETERMINACION DE LA ESPIRAMICINA POR DIFUSION EN MEDIO DE GELOSA

1 . Objeto y ámbito de aplicación

El método permite determinar la espiramicina en los alimentos y en las premezclas . El límite inferior de la determinación es de 1 mg/kg ( 1 ppm ) (1) .

2 . Principio

La muestra se somete a una extracción por una mezcla de metanol y de tampón fosfato-bicarbonato a pH 8 . El extracto se decanta o centrifuga , y después se diluye . La actividad antibiótica del extracto se determina midiendo la difusión de la espiramicina en un medio de gelosa , sembrado con Micrococcus luteus . La difusión se manifiesta por la formación de zonas de inhibición del microorganismo . El diámetro de dichas zonas se considera directamente proporcional al logaritmo de la concentración en antibiótico para la gama de concentraciones utilizadas .

3 . Microorganismo : Micrococcus luteus ATCC 9341 ( NCTC 8340 , NCIB 8553 )

3.1 . Mantenimiento de la cepa

Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) , en tubos inclinados , con Micrococcus luteus . Incubar durante 24 horas a 30 ° C , conservar en refrigerador a 4 ° C aproximadamente y renovar la siembra cada 15 días .

3.2 . Preparación de la suspensión bacteriana (a)

Recoger los gérmenes en un tubo de gelosa ( 3.1 ) de preparación reciente , con ayuda de 2 a 3 ml de solución de cloruro de sodio ( 4.3 ) . Sembrar con esta suspensión 250 ml del medio de cultivo ( 4.1 ) en un matraz de Roux e incubar durante 18 a 20 horas a 30 ° C . Recoger los gérmenes en 25 ml de solución de cloruro de sodio ( 4.3 ) y homogeneizar . Diluir la suspensión hasta 1/10 con ayuda de la solución de cloruro de sodio ( 4.3 ) . La

transmisión luminosa de la suspensión , medida a 650 nm bajo un espesor de 1 cm por comparación con la solución de cloruro de sodio ( 4.3 ) , deberá ser de 75 % aproximadamente . Esta suspensión podrá conservarse una semana a 4 ° C aproximadamente .

4 . Medios de cultivo y reactivos

4.1 . Medio de mantenimiento de la cepa (b)

Peptona de carne 6,0 g

Triptona 4,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Extracto de carne 1,5 g

Glucosa 1,0 g

Gelosa 10,0 a 20,0 g

Agua 1 000 ml

pH 6.5-6.6 ( después de la esterilización ) .

4.2 . Medio de base de la determinación (b)

Triptona 5,0 g

Extracto de levadura 4,0 g

Extracto de carne 3,0 g

Gelosa 10,0 a 20,0 g

Agua 1 000 ml

pH 8,0 ( después de la esterilización ) .

4.3 . Solución a 0,8 % ( p/v ) de cloruro de sodio

Disolver en agua 8 g de cloruro de sodio , diluir en 1 000 ml y esterilizar .

4.4 . Tampón fosfato-bicarbonato , pH 8,0

Hidrogenofosfato de potasio , K2HPO4 16,7 g

Dihidrogenofosfato de potasio , KH2PO4 0,5 g

Carbonato ácido de sodio , NaHCO3 20,0 g

Agua hasta 1 000 ml

4.5 . Mezcla de metanol y de tampón fosfato-bicarbonato ( 4.4 )

50/50 ( v/v ) .

4.6 . Sustancia patrón

Espiramicina de actividad conocida ( en UI ) .

5 . Soluciones patrón

Disolver una cantidad exactamente pesada de la sustancia patrón ( 4.6 ) en la mezcla ( 4.5 ) y diluir con la misma mezcla para obtener una solución madre a 1 000 UI de espiramicina/ml . Conservada en frasco con tapón esmerilado a 4 ° C , esta solución es estable durante 5 días .

Preparar , a partir de esta solución y por diluciones sucesivas con ayuda de la mezcla ( 4.5 ) , las soluciones siguientes :

S8 1 UI/ml

S4 0,5 UI/ml

S2 0,25 UI/ml

S1 0,125 UI/ml

6 . Preparación del extracto y de las soluciones

6.1 . Extracción

Pesar una cantidad de muestra de 20,0 g para los alimentos ; de 1,0 a 20,0 g para las premezclas . Añadir 100 ml de mezcla ( 4.5 ) y agitar durante 30

minutos . Centrifugar o decantar , diluir después la solución que flota en la superficie con ayuda de la mezcla ( 4.5 ) para obtener una concentración supuesta en espiramicina de 1 UI/ml ( = U8 ) .

Para los contenidos en espiramicina inferiores a 2,5 mg/kg de alimento , efectuar la extracción como sigue . Pesar una cantidad de muestra de 20,0 g . Añadir 100 ml de mezcla ( 4.5 ) , agitar durante 30 minutos , centrifugar después durante unos minutos . Tomar 50 ml de la solución que sobrenada y evaporar hasta 4 ml aproximadamente bajo presión reducida en un evaporador giratorio a una temperatura que no sobrepase los 40 ° C . Diluir el residuo con ayuda de la mezcla ( 4.5 ) , para obtener una concentración supuesta en espiramicina de de 1 IU/ml ( = U8 ) .

6.2 . Soluciones del extracto

Partiendo de la solución U8 , preparar por diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) , con ayuda de la mezcla ( 4.5 ) , las soluciones U4 ( concentración supuesta : 0,5 UI/ml ) , U2 ( concentración supuesta : 0,25 UI/ml ) y U1 ( concentración supuesta : 0,125 UI/ml ) .

7 . Modalidades de la determinación

7.1 . Inoculación del medio de cultivo

Sembrar a 50 ° C aproximadamente el medio de base de la determinación ( 4.2 ) con la suspensión bacteriana ( 3.2 ) . Mediante ensayos preliminares en placas con el medio ( 4.2 ) , determinar la cantidad de suspensión bacteriana que permite obtener para las diferentes concentraciones en espiramicina zonas de inhibición lo más extensas posibles y que estén todavía limpias .

7.2 . Preparación de las cajas

La difusión en gelosa se efectúa en unas cajas con cuatro concentraciones de la solución patrón ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro concentraciones del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja debe recibir necesariamente las cuatro concentraciones del patrón y del extracto . A este efecto , hay que elegir las dimensiones de las cajas de forma que se puedan ahuecar en el medio gelosado por lo menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de diámetro , cuyos centros se hallen a una distancia de por lo menos 30 mm . Como cajas , se pueden utilizar placas de vidrio planas , coronadas con un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura .

Introducir en las cajas una cantidad de medio ( 4.2 ) , sembrado como se indicó en 7.1 , que permita obtener un lecho de 2 mm aproximadamente de espesor ( 60 ml para una caja de 200 mm de diámetro ) . Dejar que se solidifique , ahuecar las cavidades y depositar volúmenes exactamente medidos de soluciones del patrón y del extracto ( 0,10 a 0,15 ml por cavidad , según el diámetro ) . Realizar por lo menos 4 repeticiones de cada concentración , de modo que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición .

7.3 . Incubación

Incubar las cajas durante 16 a 18 horas a 30 ° C ± 2 ° C .

8 . Evaluación

Medir el diámetro de las zonas de inhibición con una precisión de 0,1 mm . Para cada concentración , registrar las medidas medias en papel semilogarítmico llevando los logaritmos de las concentraciones sobre los

diámetros de las zonas de inhibición . Trazar las rectas más ajustadas para la solución patrón y para el extracto procediendo , por ejemplo , como sigue .

Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución patrón ( SL ) con ayuda de la fórmula :

( a ) SL = ( 7 s1 + 4 s2 + s4 - 2 s8 ) /10

Determinar el punto más apropiado del nivel más alto de la solución patrón ( SH ) con ayuda de la fórmula :

( b ) SH = ( 7 s8 + 4 s4 + s2 - 2 s1 ) /10

Determinar de la misma manera los puntos más apropiados del extracto para el nivel más bajo ( UL ) y el nivel más alto ( UH ) sustituyendo s1 , s2 , s4 y s8 en las fórmulas antes citadas por u1 , u2 , u4 y u8 (2) .

Llevar los valores SL y SH a la misma gráfica . Uniendo los dos puntos se obtiene de recta más ajustada para la solución patrón . Procediendo del mismo modo para UL y UH se obtiene la recta más ajustada para el extracto .

Si no hay interferencia , las rectas serán paralelas . En la práctica , se las considera paralelas cuando ( SH - SL ) y ( UH - UL ) no difieren en más de un 10 % de su media .

Si las rectas no son paralelas , se puede eliminar ya sea u1 y s1 ya sea u8 y s8 . Los valores SL , SH , UL y UH que permiten obtener las rectas más ajustadas se calculan entonces con ayuda de las fórmulas siguientes :

( a ) SL = ( 5 s1 + 2 s1 - s4 ) /6 o ( 5 s1 + 2 s4 - s8 ) /6

( b ) SH = ( 5 s4 + 2 s2 - s1 ) /6 o ( 5 s8 + 2 s4 - s2 ) /6

y fórmulas análogas para UL y UH . La utilización de esta alternativa obliga a que sean respetados los mismos criterios de paralelismo . La obtención de un resultado procedente de tres niveles debe mencionarse en el boletín de análisis .

Cuando las rectas se consideran paralelas , calcular el logaritmo de la actividad relativa ( log. A ) mediante una de las fórmulas que siguen , según el número de niveles ( 4 o 3 ) utilizados para la evaluación del paralelismo .

Para 4 niveles

( c ) log. A = ( u1 + u2 + u4 + u8 - s1 - s2 - s4 - s8 ) x 0,602/ ( u4 + u8 + s4 + s8 - u1 - u2 - s1 - s2 )

Para 3 niveles

( d ) log. A = ( ( u1 + u2 + u4 - s1 - s2 - s4 ) x 0,401 ) / ( u4 + s4 - u1 - s1 )

( d ) log. A = ( ( u2 + u4 + u8 - s2 - s4 - s8 ) x 0,401 ) / ( u8 + s8 - u2 - s2 )

Actividad del extracto de la muestra = actividad del patrón correspondiente x A :

( U8 = S8 x A )

Si la actividad relativa se encuentra fuera de la gama de valores comprendidos entre 0,5 y 2,0 repetir la determinación procediendo a los ajustes apropiados de las concentraciones de extracto o , eventualmente , de las soluciones patrón . Cuando esta actividad no pueda trasladarse a la gama de valores requeridos , el resultado deberá considerarse aproximado y esta indicación habrá de anotarse en el boletín de análisis .

Cuando las rectas se consideran paralelas , repetir la determinación . Si el paralelismo no se alcanza nunca , la determinación deberá considerarse no satisfactoria .

Expresar el resultado en mg de espiramicina base por kg de alimento .

9 . Repetibilidad

Las diferencias de los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con la misma muestra por el mismo analita no debe superar :

- 2 mg/kg en valor absoluto , para los contenidos en espiramicina base inferiores a 10 mg/kg ;

- el 20 % de resultado más alto para los contenidos de 10 a 25 mg/kg ;

- 5 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos de 25 a 50 mg/kg ;

- el 10 % del resultado más alto para los contenidos superiores a 50 mg/kg .

(1) 1 mg de espiramicina base equivale a 3 200 unidades internales ( UI ) .

(a) Puede utilizarse otros métodos , en la medida en que esté demostrado que producen suspensiones bacterianas análogas .

(b) Puede utilizarse cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga que dé los mismos resultados .

(2) Las letras minúsculas « s » y « u » se refieren a los diámetros de las zonas de inhibición .