( 84/4/CEE )

LA COMISION DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea ,

Vista la Directiva 70/373/CEE del Consejo , de 20 de julio de 1970 , relativa a la introducción de modos de toma de muestras y de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales (1) , modificada en último lugar por el Acta de adhesión de Grecia , y , en particular , su artículo 2 ,

Considerando que las Directivas 71/393/CEE (2) , 72/199/CEE (3) y 78/633/CEE (4) de la Comisión establecen , respectivamente , los métodos de determinación de las materias grasas brutas , de la virginiamicina y de la bacitracina-cinc ; que resulta necesario sustituir dichos métodos por otros adaptados a la evolución de los conocimientos científicos y técnicos ;

Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva se ajustan al dictamen del Comité permanente de alimentos animales ,

HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :

Artículo 1

En el Anexo de la Directiva 71/393/CEE , se sustituye el texto de la Parte 4 , « Determinación de las materias grasas brutas » , por el que figura en el Anexo I de la presente Directiva .

Artículo 2

En el Anexo II de la Directiva 72/199/CEE , se sustituye el texto de la Parte 5 « Determinación de la virginiamicina : por difusión en gelosa » , por el que figura en el Anexo II de la presente Directiva .

Artículo 3

En el Anexo de la Directiva 78/633/CEE , se sustituye el texto de la Parte 1 , « Determinación de la bacitracina-cinc : por difusión en gelosa » , por el que figura en el Anexo III de la presente Directiva .

Artículo 4

Los Estados miembros aplicarán las disposiciones legales , reglamentarias y administrativas necesarias para cumplir las disposiciones de la presente Directiva , a más tardar el 1 de junio de 1984 e informarán de ello inmediatamente a la Comisión .

Artículo 5

Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros .

Hecho en Bruselas , el 20 de diciembre de 1983 .

Por la Comisión

Poul DALSAGER

Miembro de la Comisión

(1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .

(2) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1972 , p. 7 .

(3) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .

(4) DO n º L 206 de 29 . 7 . 1978 , p. 43 .

ANEXO I

« 4 . DETERMINACION DE LAS MATERIAS GRASAS BRUTAS

1 . Objeto y ámbito de aplicación

El método permite determinar el contenido de materias grasas brutas de los alimentos para animales . No es válido para el análisis de las semillas y frutos oleaginosos definidos en el Reglamento ( CEE ) n º 136/66/CEE del Consejo , de 22 de septiembre de 1966 .

Según la naturaleza del alimento , debe aplicarse uno u otro de los procedimientos descritos a continuación .

1.1 . Procedimiento A

Aplicable a los alimentos simples de origen vegetal , con excepción de los que se sabe que contienen materias grasas que no pueden extraerse completamente mediante el éter de petróleo sin hidrólisis previa . En estas excepciones se incluyen los glútenes , las levaduras , las proteínas de soja y de patatas . El procedimiento es aplicable asimismo a los piensos compuestos , con excepción de los que contengan leche en polvo o cuyas materias grasas no puedan extraerse completamente mediante el éter de petróleo sin hidrólisis previa .

1.2 . Procedimiento B

Aplicable a los alimentos simples de origen animal , así como a los alimentos mencionados en el punto 1.1 como excepciones para la aplicación del procedimiento A .

2 . Principio

2.1 . Procedimiento A

Se extrae la muestra por medio de éter de petróleo . Se destila el disolvente , y se seca y pesa el residuo .

2.2 . Procedimiento B

Se trata la muestra en caliente mediante ácido clorhídrico . Se enfría y filtra la mezcla . Después de lavarlo y secarlo , el residuo se somete al análisis según el procedimiento A .

3 . Reactivos

3.1 . Eter de petróleo , intervalo de ebullición : 40 a 60 ° C . El índice de bromo debe ser inferior a 1 y el residuo de evaporación inferior a 2 mg/100 ml .

3.2 . Sulfato de sodio , anhidro .

3.3 . Acido clorhídrico 3 N .

3.4 . Coadyudante de filtración , como por ejemplo tierra de diatomeas , Hiflo-supercel .

4 . Aparatos

4.1 . Extractor . Si el aparato está provisto de un sifón ( aparato Soxhtel ) , el caudal de reflujo debe regularse de forma que se obtengan por 10 menos 10 ciclos por hora . Si se trata de un aparato sin sifón , el caudal líquido refluido debe ser de alrededor de 10 ml por minuto .

4.2 . Cartuchos de extracción , exentos de sustancias solubles en el éter de petróleo , cuya porosidad sea compatible con las exigencias del punto 4.1 .

4.3 . Estufa de secado , bien por vacío a 75 ° C ± 3 ° C , bien a presión atmosférica a 100 ° C ± 3 ° C .

5 . Modo de operación

5.1 . Procedimiento A ( véase observación 8.1 )

Pesar , con error no superior a 1 mg , 5 g de muestra , introducirlos en un cartucho de extracción ( 4.2 ) y cubrirlos con una torunda de algodón desgrasado .

Colocar el cartucho en un extractor ( 4.1 ) y extraer durante seis horas por medio de éter de petróleo ( 3.1 ) . Recoger en un matraz seco provisto de piedra pómez (1) y tarado .

Eliminar el disolvente por destilación . Secar el residuo mediante colocación del matraz durante una hora y media en una estufa de secado ( 4.3 ) . Dejar enfriar en un secador y pesar . Secar de nuevo durante treinta minutos para asegurarse de que el peso de la materia grasa se mantiene constante ( la pérdida de peso entre dos pesadas sucesivas debe ser inferior a 1 mg ) .

5.2 . Procedimiento B

Pesar , con error inferior a 1 mg , 2,5 g de de la muestra ( ver observación 8.2 ) , introducirlos en un cilindro de 400 ml o en un matraz cónico de 300 ml y añadir 100 ml de ácido clorhídrico 3 N ( 33 ) y algunos fragmentos de piedra pómez . Cubrir el cilindro con un vidrio de reloj o dotar al matraz cónico de un refrigerador de reflujo . Llevar la mezcla a ebullición suave con ayuda de una llama pequeña o de una placa eléctrica , y mantenerla así durante una hora . Evitar que el producto se pegue a las paredes del recipiente .

Enfriar y añadir una cantidad de coadyudante de filtración ( 3.4 ) suficiente para evitar cualquier pérdida de materia grasa en el momento de la filtración . Filtrar en un papel filtro doble humedecido , exento de materias grasas . Lavar el residuo con agua fría hasta la neutralidad del filtrado . Comprobar que el filtrado no contiene materias grasas . La presencia de éstas indica que debe efectuarse una extracción , de la muestra mediante éter de petróleo , según el procedimiento A , antes de la hidrólisis .

Colocar el papel filtro doble que contiene el residuo en un vidrio de reloj , y secar durante una hora y media en la estufa a 100 ° C ± 3 ° C .

Introducir el papel filtro doble que contiene el residuo seco en un cartucho de extracción ( 4.2 ) y cubrirlo con una torunda de algodón desgrasado . Colocar el cartucho en un extractor ( 4.1 ) y continuar la operación tal como se indica en los párrafos segundo y tercero del punto 5.1 .

6 . Cálculo de los resultados

Expresar el resultado de la pesada en partes por ciento de muestra .

7 . Reproducibilidad

La diferencia entre dos determinaciones paralelas efectuadas en una misma muestra mediante el mismo análisis no debe superar :

0,2 % en valor absoluto , para los contenidos de materias grasas brutas inferiores al 5 % ,

4,0 % del resultado más elevado para los contenidos del 5 al 10 % ,

0,4 % en valor absoluto , para los contenidos superiores al 10 % .

8 . Observaciones

8.1 . Para los productos con alto contenido de materias grasas , difíciles de desleír o no apropiados para la obtención de una muestra de ensayo

reducida homogénea , ha de procederse del modo siguiente .

Pesar , con un error inferior a 1 mg , 20 g de la muestra y mezclarlos con 10 g o más de sulfato de sodio anhidro ( 3.2 ) . Extraer mediante éter de petróleo ( 3.1 ) tal como se indica en el punto 5.1 . Completar el extracto obtenido hasta 500 ml con éter de petróleo ( 3.1 ) y homogeneizarlo . Introducir 50 ml de la solución en un matraz pequeño seco , provisto de algunos fragmentos de piedra pómez (1) y tarado . Eliminar el disolvente por destilación , secar y continuar la operación tal como se indica en el último párrafo del punto 5.1 .

Eliminar el disolvente del residuo de extracción presente en el cartucho , reducir el residuo a una finura de 1 mm , colocarlo de nuevo en el cartucho ( no añadir sulfato de sodio ) y continuar la operación tal como se indica en los párrafos segundo y tercero del punto 5.1 .

El contenido de materias grasas brutas en partes por ciento de muestras se determina mediante la fórmula :

( 10 a + b ) x 5

en la que :

a = masa , en gramos , del residuo de la primera extracción ( parte alícuota del extracto ) ,

b = masa , en gramos , del residuo de la segunda extracción .

8.2 . La cantidad para ensayo de los productos pobres en materias grasas puede aumentarse a 5 g . »

(1) Sustituir los fragmentos de piedra pómez por perlas de vidrio cuando la materia grasa deba someterse a exámenes cualitativos ulteriores .

ANEXO II

« 5 . DETERMINACION DE LA VIRGINIAMICINA

- por difusión en gelosa -

1 . Objeto y ámbito de aplicación

El método permite determinar la virginiamicina en los alimentos y en las premezclas . El límite inferior de la determinación es de 2 mg/kg ( 2 ppm ) (1) .

2 . Principio

Se somete la muestra a una extracción mediante una solución metanólica de Tween 80 . El extracto se decanta o centrifuga , y se diluye después . Su actividad antibiótica se determina por mediación de la difusión de la virginiamicina en un medio de gelosa , sembrado con Micrococcus luteus . La difusión se manifiesta por la formación de zonas de inhibición del microorganismo . El diámetro de dichas zonas se considera directamente proporcional al logaritmo de la concentración de antibiótico para la gama de concentraciones utilizadas .

3 . Microorganismos : « Micrococcus luteus » ATCC 9341 ( NCTC 8340 , NCIB 8553 )

3.1 . Mantenimiento de la cepa

Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) , en tubos inclinados , con Micrococcus luteus . Incubar durante veinticuatro horas a 30 ° C , conservar en frigorífico a unos 4 ° C y renovar la siembra cada quince días .

3.2 . Preparación de la suspensión bacteriana (a)

Recoger los gérmenes en un tubo de gelosa ( 3.1 ) , de preparación reciente

, con ayuda de 2 a 3 ml de solución de cloruro sódico ( 4.3 ) . Sembrar con esta suspensión 250 ml del medio de cultivo ( 4.1 ) en un matraz de Roux e incubar durante dieciocho a veinte horas a 30 ° C . Recoger los gérmenes en 25 ml. de solución de cloruro sódico ( 4.3 ) y homogeneizar .

Diluir la suspensión a 1/10 con ayuda de la solución de cloruro sódico ( 4.3 ) . La transmisión luminosa de la suspensión , medida a 650 mm bajo un espesor de 1 cm por comparación con la solución de cloruro sódico ( 4.3 ) , debe ser de alrededor del 75 % . Esta suspensión puede conservarse una semana a unos 4 ° C .

4 . Medios de cultivo y reactivos

4.1 . Medio de mantenimiento de la cepa y de base de la determinación (b)

Peptona de carne 6,0 g

Triptona 4,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Extracto de carne 1,5 g

Glucosa 1,0 g

Gelosa 10,0 a 20,0 g

Agua 1 000 ml

pH 6,5 ( tras esterilización )

4.2 . Tampón fosfato , pH 6

Hidrogenofosfato de potasio K2HPO4 2,0 g

Dihidrogenofosfato de potasio KH2PO4 8,0 g

Agua hasta 1 000 ml

4.3 . Solución a 0,8 % ( p/v ) de cloruro sódico : disolver en agua 8 g de cloruro sódico , diluir hasta 1 000 ml y esterilizar .

4.4 . Matanol .

4.5 . Mezcla de tampón fosfato ( 4.2 ) y de metanol ( 4.4 ) : 80/20 ( v/v ) .

4.6 . Solución en metanol al 0,5 % ( p/v ) de Tween 80 : disolver 5 g de Tween 80 en metanol ( 4.4 ) y diluir hasta 1 000 ml con metanol .

4.7 . Sustancia de referencia : virginiamicina de actividad conocida .

5 . Soluciones de referencia

Disolver una cantidad pesada exactamente de la sustancia de referencia ( 4.7 ) en el metanol ( 4.4 ) y diluir con metanol ( 4.4 ) para obtener una solución madre a 1 000 µg de virginiamicina/ml . Conservada en un matraz tapado a 4 ° C , esta solución es estable durante 5 días .

Preparar , a partir de esta solución y mediante diluciones sucesivas con la ayuda de la mezcla ( 4.5 ) , las soluciones siguientes :

S8 1 µg/ml

S4 0,5 µg/ml

S2 0,25 µg/ml

S1 0,125 µg/ml

6 . Preparación del extracto y de las soluciones

6.1 . Extracción

6.1.1 . Productos cuyo contenido en viginiamicina no excede de 100 mg/kg

Pesar una cantidad de muestra de 50,0 g . Añadir 200 ml de solución ( 4.6 ) , agitar durante 30 minutos y dejar luego sedimentar o centrifugar . Recoger 20 ml de la solución sobrenadante y evaporar hasta 5 ml en un evaporador

rotatorio a una temperatura que no exceda de 40 ° C . Disolver el residuo con ayuda de la mezcla ( 4.5 ) para obtener una concentración supuesta de virginiamicina de 1 µg/ml ( = U8 ) .

6.1.2 . Productos cuyo contenido en virginiamicina es superior a 100 mg/kg

Pesar una cantidad de muestra que no exceda de 10,0 g y contenga de 1 a 50 mg de virginiamicina . Añadir 100 ml de solución ( 4.6 ) , agitar durante 30 minutos , y dejar sedimentar luego o centrifugar . Disolver la solución sobrenadante con ayuda de la mezcla ( 4.5 ) para obtener una concentración de virginiamicina de 1 µg/ml ( = U8 ) .

6.2 . Soluciones del extracto

Preparar , a partir de la solución U8 y por diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con ayuda de la mezcla ( 4.5 ) , las soluciones U4 ( concentración supuesta : 0,5 µg/ml , U2 ( concentración supuesta : 0,25 µg/ml ) y U1 ( concentración supuesta : 0,125 µg/ml ) .

7 . Modalidades de la determinación

7.1 . Inoculación del medio de cultivo

Sembrar a unos 50 ° C el medio de base de la determinación ( 4.1 ) con la suspensión bacteriana ( 3.2 ) . Mediante ensayos preliminares sobre placas con el medio ( 4.1 ) , determinar la cantidad de suspensión bacteriana que permite obtener para las diferentes concentraciones de virginiamicina zonas de inhibición lo más amplias posibles sin dejar de ser nítidas .

7.2 . Preparación de las cajas

La difusión en gelosa se efectúa en cajas con las cuatro concentraciones de la solución de referencia ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro concentraciones del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja debe recibir necesariamente las cuatro concentraciones de la referencia y del extracto . A tal fin , hay que elegir la dimensión de las cajas de forma que se puedan excavar en el medio de gelosa por lo menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de diámetro , cuyos centros no disten menos de 30 mm . Pueden emplearse como cajas placas de vidrio planas , coronadas por un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura .

Introducir en las cajas una cantidad del medio ( 4.1 ) , sembrado tal como se indica en 7.1 , que permita obtener una capa de unos 2 mm de grosor ( 60 ml para una caja de 200 mm de diámetro ) . Dejar solidificar , excavar las cavidades y depositar en ellas volúmenes exactamente medidos de las soluciones de la referencia y del extracto ( 0,10 a 0,15 ml por cavidad según el diámetro ) . Repetir por lo menos cuatro veces cada concentración , de forma que cada determinación comprenda la valoración de 32 zonas de inhibición .

7.3 . Incubación

Incubar las cajas durante dieciséis a dieciocho horas a 30 ° C I 2 ± ° C .

8 . Valoración

Medir el diámetro de las zonas de inhibición con un error no superior a 0,1 mm . Para cada concentración , registrar las medidas en papel semilogarítmico , trasladando el logaritmo de las concentraciones en relación con los diámetros de las zonas de inhibición . Trazar las rectas más ajustadas para la solución de referencia y para el extracto , por ejemplo , mediante el procedimiento siguiente :

Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución de referencia ( SL ) con ayuda de la fórmula :

( a ) SL = ( 7s1 + 4s2 + s4 - 2s8 ) /10

Determinar el punto más apropiado del nivel más alto de la solución de referencia ( SH ) con ayuda de la fórmula :

( b ) SH = ( 7s8 + 4s4 + s2 - 2s1 ) /10

Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto para el nivel más bajo ( UL ) y el nivel más alto ( UH ) sustituyendo S1 , S2 , S4 y S8 en las fórmulas anteriores por U1 , U2 , U4 y U8 .

Consignar los valores SL y SH en la misma gráfica . Al unir los dos puntos , se obtiene la recta más ajustada para la solución de referencia . Si se sigue el mismo método para UL y UH , se obtiene la recta más ajustada para el extracto .

Si no hubiere ninguna interferencia , las rectas se consideran paralelas cuando ( SH - SL ) y ( UH - UL ) no difieren en más de un 10 % de su media .

Si las rectas no son paralelas , pueden eliminarse U1 y S1 , o U8 y S8 . Los valores SL , SH , UL y UH que permiten obtener las rectas más ajustadas se calculan entonces con ayuda de las fórmulas siguientes :

( a' ) SL = ( 5s1 + 2s2 - s4 ) /6 ó ( 5s2 + 2s4 - s8 ) /6

( b' ) SH = ( 5s4 + 2s2 - s1 ) /6 ó ( 5s8 + 2s4 - s2 ) /6

y de fórmulas análogas para UL y UH . La utilización de esta alternativa obliga a respetar los mismos criterios de paralelismo .

En el boletín de análisis debe mencionarse la obtención de un resultado procedente de tres niveles .

Cuando las rectas se consideren paralelas , hay que calcular el logaritmo de la actividad relativa ( log A ) mediante una de las fórmulas siguientes , según el número de niveles ( 4 o 3 ) utilizados para la valoración del paralelismo .

Para 4 niveles :

( c ) log A = ( ( u1 + u2 + u4 + u8 - s1 - s2 - s4 - s8 ) x 0,602 ) / ( u4 + u8 + s4 + s8 - u1 - u2 - s1 - s2 )

Para 3 niveles :

( d ) log A = ( ( u1 - u2 - u4 - s1 - s2 - s4 ) x 0,401 ) / ( u4 - s4 - u1 - s1 )

( d' ) log A = ( ( u2 - u4 - u8 - s2 - s4 - s8 ) x 0,401 ) / ( u8 - s8 - u2 - s2 )

Actividad del extracto de la muestra = actividad de la referencia correspondiente x A :

( U8 = S8 x A )

Si la actividad relativa no se encuentra en la gama de valores comprendidos entre 0,5 y 2,0 , ha de repetirse la determinación procediendo a los ajustes apropiados de las concentraciones del extracto o , en su caso , de las soluciones de referencia . Cuando actividad no pueda encuadrarse en la gama de los valores exigidos , el resultado se considerará aproximado y así se hará constar en el boletín de análisis .

Cuando las rectas no se consideren paralelas , se repetirá la determinación . Si tampoco ahora se lograre el paralelismo , la determinación se considerará insatisfactoria .

Expresar el resultado en miligramos de virginiamicina por kilogramo de alimento .

9 . Reproducibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas en la misma muestra por el mismo analista no debe exceder de :

2 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos de virginiamicina inferiores a 10 mg/kg ,

20 por 100 del resultado más alto , para los contenidos de 10 a 25 mg/kg ,

5 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos de 25 a 50 mg/kg ,

10 por 100 del resultado más alto , para los contenidos superiores a 50 mg/kg . »

(1) 1 mg de virginiamicina equivale a 1 000 unidades « UK » .

(a) Pueden utilizarse otros métodos , siempre que esté demostrado que producen suspensiones bacterianas análogas .

(b) Puede utilizarse cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que dé los mismos resultados .

ANEXO III

« 1 . DETERMINACION DE LA BACITRACINA-CINC

- por difusión en gelosa -

1 . Objeto y ámbito de aplicación

El método permite determinar la bacitracina-cinc en los alimentos las premezclas . El límite inferior de la determinación es de 5 mg/kg ( 5 ppm ) (1) .

2 . Principio

Se extrae la muestra a pH 2 mediante una mezcla de etanol , agua y ácido clorhídrico y una solución de sulfuro sódico . El sulfuro sódico permite precipitar las sales de cobre solubles que pudieran obstaculizar la determinación . El extracto , llevado a pH 6,5 , se concentra ( en caso necesario ) y diluye . Su actividad antibiótica se determina por medición de la difusión de la bacitracina-cinc en un medio de gelosa , sembrado con Micrococcus luteus ( flavus ) . La difusión se manifiesta mediante la formación de zonas de inhibición del microorganismo . El diámetro de dichas zonas se considera directamente proporcional al logaritmo de la concentración de antibiótico para la gama de concentraciones utilizadas .

3 . Microorganismo : « Micrococcus luteus ( flavus ) » ATCC 10240

3.1 . Mantenimiento de la cepa

Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) , en tubos inclinados , con Micrococcus luteus ( flavus ) . Incubar durante veinticuatro horas a 30 ° C , conservar en frigorífico a unos 4 ° C y renovar la siembra cada quince días .

3.2 . Preparación de la suspensión bacteriana (a)

Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa ( 3.1 ) , de preparación reciente , con la ayuda de 2 a 3 ml de solución de cloruro sódico ( 4.3 ) . Sembrar con esta suspensión 250 ml del medio de cultivo ( 4.1 ) en un matraz de Roux e incubar durante dieciocho a veinte horas a 30 ° C . Recoger los gérmenes en 25 ml de solución de cloruro sódico ( 4.3 ) y homogeneizar .

Diluir la suspensión a 1/10 con ayuda de la solución de cloruro sódico ( 4.3 ) . La transmisión luminosa de la solución , medida a 650 mm bajo un espesor de 1 cm por comparación con la solución de cloruro sódico ( 4.3 ) , debe ser

de alrededor del 75 % . Esta suspensión puede conservarse una semana a unos 4 ° C .

4 . Medios de cultivo y reactivos

4.1 . Medio de mantenimiento de la cepa (b)

Peptona de carne 6,0 g

Triptona 4,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Extracto de carne 1,5 g

Glucosa 1,0 g

Gelosa 10,0 a 20,0 g

Agua 1 000 ml

pH 6,5 - 6,6 ( tras esterilización )

4.2 . Medio de base de la determinación (b)

Triptona 10,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Extracto de carne 1,5 g

Glucosa 1,0 g

Gelosa 10,0 a 20,0 g

Tween 80 1 ml

Agua 1 000 ml

pH 6,5 ( tras esterilización )

4.3 . Solución al 0,8 % ( p/v ) de cloruro sódico : disolver en agua 8 g de cloruro sódico , diluir a 1 000 ml y esterilizar .

4.4 . Mezcla de metanol/agua/ácido clorhídrico ( 4.6 ) : 80/17,5/2,5 ( v/v/v ) .

4.5 . Tampón fasfato , pH 6,5

Fosfato bipotásico K2HPO4 22,15 g

Fosfato monopotásico KH2PO4 27,85 g

Agua hasta 1 000 ml

4.6 . Acido clorhídrico , d : 1,18-1,19

4.7 . Acido clorhídrico , 0,1 M

4.8 . Solución 1 M de hidróxido sódico

4.9 . Solución 0,5 M , aproximadamente , de sulfuro sódico

4.10 . Solución al 0,04 % ( p/v ) de púrpura de bromocresol :

disolver 0,1 g de púrpura de bromocresol en 18,5 ml de solución 0,01 M de hidróxido sódico . Completar hasta 250 ml con agua y homogeneizar .

4.11 . Sustancia de referencia : bacitracina-cinc de actividad conocida ( en UI ) .

5 . Soluciones de referencia

Pesar una cantidad de sustancia de referencia ( 4.11 ) correspondiente a 1 050 UI ( según el título indicado ) . Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 0,1 M ( 4,7 ) y dejar reposar quince minutos . Añadir 30 ml de agua , ajustar el pH a 4,5 con la ayuda del tampón fosfato ( 4.5 ) ( unos 4 ml ) , completar hasta 50 ml con agua y homogeneizar ( 1 ml = 21 UI ) .

Preparar , a partir de esta solución y mediante diluciones sucesivas con ayuda del tampón fosfato pH 6,5 ( 4.5 ) , las soluciones siguientes :

S8 0,42 UI/ml

S4 0,21 UI/ml

S2 0,105 UI/ml

S1 0,0525 UI/ml

6 . Preparación del extracto

6.1 . Extracción

6.1.1 . Premezclas y alimentos minerales

Pesar una cantidad de mezcla de 2,0 a 5,0 g , añadir 29,0 ml de la mezcla ( 4.4 ) y 1,0 ml de solución de sulfuro sódico ( 4.9 ) ; agitar brevemente . Comprobar que el pH es de alrededor de 2 . Agitar durante 10 minutos , añadir 30 ml de tampón fosfato ( 4.5 ) , agitar durante 15 minutos y centrifugar . Tomar una parte alícuota de la solución sobrenadante y ajustar el pH a 6,5 con ayuda de la solución 1 M de hidróxido sódico ( 4.8 ) utilizando un pHmetro o la solución de púrpura de bromocresol ( 4.10 ) como indicador .

Diluir con ayuda del tampón fosfato ( 4.5 ) para obtener una concentración supuesta en bacitracina-cinc de 0,42 UI/ml ( = U8 ) .

6.1.2 . Concentrados proteínicos

Pesar una cantidad de muestra de 10,0 g , añadir 49,0 ml de la mezcla ( 4.4 ) y 1,0 ml de la solución de sulfuro sódico ( 4.9 ) ; agitar brevemente . Comprobar que el pH es de alrededor de 2 . Agitar durante 10 minutos , añadir 50 ml de tampón fosfato ( 4.5 ) , agitar durante 15 minutos y centrifugar . Tomar una parte alícuota de la solución sobrenadante y ajustar el pH a 6,5 con ayuda de la solución 1 M de hidróxido sódico ( 4.8 ) utilizando un pHmetro o la solución de púrpura de bromocresol ( 4.10 ) como indicador .

Evaporar aproximadamente la mitad del volumen en un evaporador rotatorio a una temperatura que no exceda de 35 ° C . Diluir con ayuda del tampón fosfato ( 4.5 ) para obtener una concentración supuesta en bacitracina-cinc de 0,42 UI/ml ( = U8 ) .

6.1.3 . Otros alimentos

Pesar una cantidad de muestra de 10 g ( 20,0 g para una concentración supuesta de bacitracina-cinc de 5 mg/kg ) . Añadir 24,0 ml de mezcla ( 4.4 ) y 1,0 ml de solución de sulfuro sódico ( 4.9 ) ; homogeneizar durante 10 minutos . Añadir 25 ml de tampón fosfato ( 4.5 ) , agitar durante 15 minutos y centrifugar . Tomar 20 ml de la solución sobrenadante y ajustar el pH a 6,5 con ayuda de la solución 1 M de hidróxido sódico ( 4.8 ) utilizando un pHmetro o la solución de púrpura de bromocresol ( 4.10 ) como indicador . Evaporar hasta 4 ml aproximadamente en un evaporador rotatorio a una temperatura que no exceda de 35 ° C . Diluir el residuo con ayuda del tampón fosfato ( 4.5 ) para obtener una concentración supuesta de bacitracine-cinc de 0,42 UI/ml ( = U8 ) .

6.2 . Soluciones del extracto

Preparar , a partir de la solución U8 y por diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con la ayuda del tampón fosfato ( 4.5 ) , las soluciones U4 ( concentración supuesta : 0,21 UI/ml ) , U2 ( concentración supuesta : 0,105 UI/ml ) y U1 ( concentración supuesta : 0,0525 UI/ml ) .

7 . Modalidades de determinación

7.1 . Inoculación del medio de cultivo

Sembrar a unos 50 ° C el medio de base de la determinación ( 4.2 ) con la

suspensión bacteriana ( 3.2 ) mediante ensayos preliminares en placas con el medio ( 4.2 ) , determinar la cantidad de suspensión bacteriana que permite obtener para las diferentes concentraciones de bacitracina-cinc zonas de inhibición lo más amplias posibles sin dejar de ser nítidas .

7.2 . Preparación de las cajas

La difusión en gelosa se efectúa en cajas con las cuatro concentraciones de la solución de referencia ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro concentraciones del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja debe recibir necesariamente las cuatro concentraciones de referencia y del extracto . A tal fin , hay que elegir la dimensión de las cajas de forma que se puedan excavar en el medio de gelosa por lo menos 8 cavidades de 10 a 13 mm de diámetro , cuyos centros no disten menos de 30 mm . Pueden emplearse como cajas placas de vidrio planas , coronadas por un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura .

Introducir en las cajas una cantidad del medio ( 4.2 ) , sembrado tal como se indica en 7.1 , que permita obtener una capa de unos 2 mm de grosor ( 60 ml para una caja de 200 mm de diámetro ) . Dejar solidificar , excavar las cavidades y depositar en ellas volúmenes exactamente medidos de las soluciones de referencia y del extracto ( 0,10 a 0,15 ml por cavidad según el diámetro ) . Repetir por lo menos cuatro veces cada concentración , de forma que cada determinación comprenda la valoración de 32 zonas de inhibición .

7.3 . Incubación

Incubar las cajas durante dieciséis a dieciocho horas a 30 ° C ± 2 ° C .

8 . Valoración

Medir el diámetro de las zonas de inhibición con un error no superior a 0,1 mm . Para cada concentración , registrar las medidas medias en papel semilogarítmico , trasladando el logaritmo de las concentraciones en relación con los diámetros de las zonas de inhibición . Trazar las rectas más ajustadas para la solución de referencia y para el extracto , por ejemplo , mediante el procedimiento siguiente :

Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución de referencia ( SL ) con ayuda de la fórmula :

( a ) SL = ( 7s1 + 4s2 + s4 - 2s8 ) /10

Determinar el punto más apropiado del nivel más alto de la solución de referencia ( H ) con ayuda de la fórmula :

( b ) SH = ( 7s8 + 4s4 + s2 - 2s1 ) /10

Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto para el nivel más bajo ( UL ) y el nivel más alto ( UH ) sustituyendo S1 , S2 , S4 y S8 en las fórmulas anteriores por U1 , U2 , U4 y U8 .

Consignar los valores SL y SH en la misma gráfica . Al unir los dos puntos se obtiene la recta más ajustada para la solución de referencia . Si se sigue el mismo método para UL y UH se obtiene la recta más ajustada para el extracto .

Si no hubiere ninguna interferencia , las rectas serían paralelas . En la práctica , se consideran paralelas cuando ( SH - SL ) y ( UH - UL ) nodifieren en más de un 10 % de su media .

Si las rectas no son paralelas , pueden eliminarse U1 y S1 , o U8 y S8 . Los

valores SL , SH , UL y UH que permiten obtener las rectas más ajustadas se calculan entonces con ayuda de las fórmulas siguientes :

( a' ) SL = ( 5s1 + 2s2 - s4 ) /6 ó ( 5s2 - 2s4 - s8 ) /6

( b' ) SH = ( 5s4 - 2s2 - s1 ) /6 ó ( 5s8 + 2s4 - s2 ) /6

y de fórmulas análogas para UL y UH . La utilización de esta alternativa obliga a respetar los mismos criterios de paralelismo . En el boletín de análisis debe mencionarse la obtención de un resultado procedente de tres niveles .

Cuando las rectas se consideren paralelas , hay que calcular el logaritmo de la actividad relativa ( log A ) mediante una de las fórmulas siguientes , según el número de niveles ( 4 o 3 ) utilizados para la valoración del paralelismo .

Para 4 niveles :

( c ) log A = ( ( u1 + u2 + u4 + u8 - s1 - s2 - s4 - s8 ) x 0,602 ) / ( u4 + u8 + s4 + s8 - u1 - u2 - s1 - s2 )

Para 3 niveles :

( d ) log A = ( ( u1 - u2 - u4 - s1 - s2 - s4 ) x 0,401 ) / ( u4 - s4 - u1 - s1 )

( d' ) log A = ( ( u2 - u4 - u8 - s2 - s4 - s8 ) x 0,401 ) / ( u8 - s8 - u2 - s2 )

Actividad del extracto de la muestra = actividad de la referencia correspondiente x A :

( U8 = S8 x A )

Si la actividad relativa no se encuentra en la gama de valores comprendidos entre 0,5 y 2,0 , ha de repetirse la determinación procediendo a los ajustes apropiados de las concentraciones del extracto o , en su caso , de las soluciones de referencia . Cuando esta actividad no pueda encuadrarse en la gema de los valores exigidos , el resultado se considerará aproximado y así se hará constar en el boletín de análisis .

Cuando las rectas no se consideren paralelas , se repetirá la determinación . Si tampoco ahora se lograre el paralelismo , la determinación se considerará insatisfactoria .

Expresar el resultado en miligramos de bacitracinacinc por kilogramo de alimento .

9 . Reproducibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas en la misma muestra por el mismo analista no debe exceder de :

2 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos de bacitracina-cinc inferiores a 19 mg/kg ,

20 % del resultado más alto , para los contenidos de 10 a 25 mg/kg ,

5 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos de 25 a 50 mg/kg ,

10 % del resultado más alto , para los contenidos superiores a 50 mg/kg . »

(1) 1 mg de bacitracina-cinc ( calidad para alimentos para animales ) equivale a 42 unidades internacionales ( UI ) .

(a) Pueden utilizarse otros métodos , siempre que esté demostrado que producen suspensiones bacterianas análogas .

(b) Puede utilizarse cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que dé los mismos resultados .