LA COMISION DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea ,

Vista la Directiva del Consejo , de 20 de julio de 1970 , referente a la introducción de modos de tomas de muestras y de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de la alimentación animal (1) , modificada en último lugar por el Acta de adhesión (2) y , en particular , su artículo 2 ,

Considerando que la Directiva arriba contemplada prevé que los controles oficiales de la alimentación animal dirigidos a comprobar que se respetan las condiciones prescritas en virtud de las disposiciones legales , reglamentarias y administrativas referentes a la calidad y a la composición de la alimentación animal , se llevan a cabo según los modos de tomas de muestras y los métodos de análisis comunitarios ,

Considerando que las Directivas 71/250/CEE , 71/393/CEE , 72/199/CEE , 73/46/CEE , 74/203/CEE y 75/84/CEE de la Comisión , de 15 de junio de 1971 (3) , 18 de noviembre de 1971 (4) , 27 de abril de 1972 (5) , 5 de diciembre de 1972 (6) , 25 de marzo de 1974 (7) y 20 de diciembre de 1974 (8) , establecieron ya un determinado número de métodos de análisis comunitarios ; que habida cuenta del avanzado estado de los trabajos llevados a cabo desde entonces , conviene adoptar una séptima serie de métodos ,

Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva concuerdan con el dictamen del Comité permanente de la alimentación animal .

HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :

Artículo 1

Los Estados miembros dispondrán que los análisis para los controles oficiales de alimentación animal , en lo referente a su contenido en aflatoxina B1 se llevarán a cabo según los métodos descritos en el Anexo de la presente Directiva .

Las disposiciones generales que figuren en la parte I ( introducción ) del Anexo de la primera Directiva 71/250/CEE de la Comisión , de 15 de junio de 1971 , excepto la parte referente a la preparación de la muestra que debe analizarse , serán aplicables a los métodos descritos en el Anexo de la presente Directiva .

Artículo 2

Los Estados miembros aplicarán , a más tardar , el 1 de octubre de 1976 , las disposiciones legales , reglamentarias y administrativas necesarias para cumplir la presente Directiva e informarán de ello inmediatamente a la Comisión .

Artículo 3

Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros .

Hecho en Bruselas , el 1 de marzo de 1976 .

Por la Comisión

P. J. LARDINOIS

Miembro de la Comisión

(1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .

(2) DO n º L 73 de 27 . 3 . 1972 , p. 14 .

(3) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .

(4) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .

(5) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .

(6) DO n º L 83 de 30 . 3 . 1973 , p. 21 .

(7) DO n º L 108 de 22 . 4 . 1974 , p. 7 .

(8) DO n º L 32 de 5 . 2 . 1975 , p. 26 .

ANEXO

DOSIFICACION DE LA AFLATOXINA B1

A . METODO POR CROMATOGRAFIA MONODIMENSIONAL EN CAPA FINA

1 . Objeto y ámbito de aplicación

El método permite determinar el contenido de aflatoxina B1 de los alimentos siguientes : tortas de cacahuetes , de copra , de lino , de soja , de sésamo de babasú y de gérmenes de maíz , cereales y derivados , harina de guisantes , pulpa y fécula de patatas . El límite inferior de la dosificación es de 0,01 mg/kg ( 10 ppb ) .

En presencia de sustancias interferentes que obstaculicen las determinaciones , conviene recomenzar el análisis según el método B ( por cromatografía bidimensional en capa fina ) .

2 . Principio

La muestra se somete a la extracción mediante cloroformo . Se filtra el extracto y se toma del mismo una parte alicuota que es purificada mediante cromatografía en columna de gel de sílice . El eluido se evapora y el residuo se vuelve a tomar mediante un volumen determinado de cloroformo o de una mezcla de benceno y acetonitrilo . Una parte alicuota de dicha solución se somete a la cromatografía en capa fina . La cantidad de aflatoxina B1 se determina bajo irradiación ultravioleta del cromatograma bien sea visualmente , o a través de fluordensitometría , mediante comparación con cantidades conocidas de aflatoxina B1-tipo . La identidad de la aflatoxina B1 extraida del alimento debe confirmarse mediante los procedimientos indicados .

3 . Reactivos

NB : Todos los reactivos deben ser de calidad « para el análisis » en la medida en que no se ha dado ninguna otra indicación .

3.1 . Acetona .

3.2 . Cloroformo , estabilizado del 0,5 al 1,0 por ciento de etanol de 96 ° ( v/v ) .

3.3 . n-Hexano .

3.4 . Metanol .

3.5 . Eter dietílico anhídrido , exento de peróxidos .

3.6 . Mezcla de benceno y de acetonitrilo : 98/2 ( v/v ) .

3.7 . Mezcla de cloroformo ( 3.2 ) y de metanol ( 3.4 ) : 97/3 ( v/v ) .

3.8 . Gel de sílice , para cromatografía en columna , granulometría : de 0,05 a 0,20 mm .

3.9 . Algodón hidrófilo , previamente desengrasado mediante cloroformo , o lana de vidrio .

3.10 . Sulfato de sodio , anhidro , granulado .

3.11 . Gas inerte , por ejemplo : ázoe .

3.12 . Acido clorhídrico 1 N .

3.13 . Acidó sulfúrico al 50 por ciento ( v/v ) .

3.14 . Tierra de diatomeas ( Hiflosupercel ) lavada con ácido .

3.15 . Gel de sílice G-HR o equivalente , para cromatografía en capa fina .

3.16 . Solución tipo de 0,1 mgr. aproximadamente de aflatoxina B1 por

milímetro en el cloroformo ( 3.2 ) o en la mezcla de benceno/acetonitrilo ( 3.6 ) , preparada y controlada como se indica en el punto 7 .

3.17 . Solución tipo cualitativa de 0,1 mgr. aproximadamente de aflatoxina B1 y B2 por ml en el cloroformo ( 3.2 ) o en la mezcla benceno/acetonitrilo ( 3.6 ) . Estas concentraciones se dan a título indicativo y deben ajustarse con objeto de obtener la misma intensidad de fluorescencia para las dos aflatoxinas .

3.18 . Disolventes de revelado :

3.18.1 . Cloroformo ( 3.2 ) /acetona ( 3.1 ) : 9/1 ( v/v ) , cubeta no saturada ;

3.18.2 . Eter dietílico ( 3.5 ) /metanol ( 3.4 ) /agua : 96/3/1 ( v/v/v ) , cubeta no saturada ;

3.18.3 . Eter dietílico ( 3.5 ) /metanol ( 3.4 ) /agua : 94/4,5/1,5 ( v/v/v ) , cubeta saturada ;

3.18.4 . Cloroformo ( 3.2 ) /metanol ( 3.4 ) : 94/6 ( v/v ) , cubeta saturada ;

3.18.5 . Cloroformo ( 3.2 ) /metanol ( 3.4 ) : 97/3 ( v/v ) , cubeta saturada .

4 . Equipo

4.1 . Triturador-mezclador .

4.2 . Aparato para agitar o agitador magnético .

4.3 . Filtros plegados , Schleicher y Schuell n º 588 o equivalente , diámetro : 24 cm .

4.4 . Tubos para cromatografía , de cristal ( diámetro interior : 22 mm , longitud 300 mm ) , con grifo de teflón y depósito de 250 ml .

4.5 . Aparato rotativo de evaporación en vacío , con matraz de 500 ml .

4.6 . Frascos cónicos de 500 ml , con tapón esmerilado .

4.7 . Equipo para cromatografía en capa fina .

4.8 . Placas de vidrio para cromatografía en capa fina , 200 por 200 mm , preparadas de la siguiente manera ( con las cantidades indicadas se pueden recubrir cinco placas ) : introducir 30 grs. de gel de sílice G-HR ( 3.15 ) en un frasco cónico , añadir 60 ml de agua , tapar y agitar durante un minuto . Extender la suspensión en las placas con objeto de obtener una capa uniforme de 0,25 mm de espesor . Dejar secar al aire y conservar después en un desecador provisto de gel de sílice . En el momento de su utilización , activar las placas manteniéndolas durante una hora en la estufa a 110 n º C .

Las placas ya listas para su utilización son prácticas en la medida en que dan resultados parecidos a los de las placas preparadas según se ha indicado más arriba .

4.9 . Lámpara ultravioleta de ondas largas ( 360 nm ) . La intensidad de irradiación debe permitir distinguir , incluso con claridad , una mancha de 1,0 ngr. de aflatoxina B1 en una placa para cromatografía en capa fina , a una distancia de 10 cm de la lámpara .

4.10 . Tubos de 10 ml , graduados , con tapones de polietileno .

4.11 . Espectrofotómetro ultravioleta .

4.12 . Fluordensitómetro ( eventualmente ) .

5 . Modo de operar

5.1 . Preparación de la muestra ( ver las observaciones del punto 1 de la parte C )

Triturar la muestra de manera que pase completamente a través de un tamiz de mallas del mm ( conforme a la recomendación ISO R 565 ) .

5.2 . Extracción

Introducir 50,0 g de la muestra molida y homogeneizada en un frasco cónico de 500 ml ( 4.6 ) . Añadir 25 g de tierra de diatomeas ( 3.14 ) , 25 ml de agua y 250 ml de cloroformo ( 3.2 ) . Tapar el frasco , sacudir o agitar durante 30 minutos con ayuda del aparato ( 4.2 ) y filtrar mediante el filtro plegado ( 4.3 ) . Eliminar los 10 primeros ml del resultado de la filtración y recoger a continuación 50 ml .

5.3 . Purificación en columna

Proveer la extremidad inferior de un tubo para cromatografía ( 4.4 ) de un tapón de algodón o de lana de vidrio ( 3.9 ) , llenar los dos tercios del tubo de cloroformo ( 3.2 ) y añadir 5 g de sulfato de sodio ( 3.10 ) .

Comprobar que la superficie superior de la capa de sulfato de sodio está plana ; añadir a continuación , en pequeñas porciones , 10 g de gel de sílice ( 3.8 ) . Remover con precaución después de cada adición con el fin de eliminar las burbujas de aire . Dejar que se pose durante 15 minutos y añadir seguidamente , con precaución , 15 g de sulfato de sodio ( 3.10 ) . Dejar descender el líquido hasta la proximidad inmediata de la superficie superior de la capa de sulfato de sodio .

Mezclar los 50 ml de extracto recogidos en 5.2 con 100 ml de n-hexano ( 3.3 ) y transvasar cuantitativamente la mezcla en la columna . Dejar descender el líquido hasta la superficie superior de la capa de sulfato de sodio . Eliminar el líquido derramado . Añadir a continuación 100 ml de éter dietílico ( 3.5 ) y dejar descender de nuevo el líquido hasta la superficie superior de la capa de sulfato de sodio . Durante estas operaciones , procurar que el líquido derramado sea de 8 a 12 ml por minuto y que la columna no se vacíe . Eliminar los líquidos derramados . Eluir después mediante 150 ml de la mezcla cloroformo/metanol ( 3.7 ) y recoger la totalidad del eluido .

Evaporar éste casi hasta vaciarlo , bajo una corriente de gas inerte ( 3.11 ) y a una temperatura que no supere los 50 n ° C , mediante el aparato rotativo de evaporación en vacío ( 4.5 ) . Introducir cuantitativamente el residuo por medio de cloroformo ( 3.2 ) o de la mezcla benceno/acetonitrilo ( 3.6 ) en un tubo de 10 ml ( 4.10 ) . Concentrar la solución bajo una corriente de gas inerte ( 3.11 ) y llevar después el volumen a 2,0 ml por medio de cloroformo ( 3.2 ) o de la mezcla benceno/acetonitrilo ( 3.6 ) .

5.4 . Cromatografía en capa fina

Depositar puntualmente en una placa para cromatografía en capa fina ( 4.8 ) , a 2 cm del borde inferior y a intervalos de 2 cm , los volúmenes de la solución tipo y del extracto indicados a continuación :

- 10 , 15 , 20 , 30 y 40 ml de la solución tipo de aflatoxina B1 ( 3.16 ) ;

- 10 ml del extracto obtenido en 5.3 y , en superposición en el mismo punto , 20 ml de la solución tipo ( 3.16 ) ;

- 10 y 20 ml del extracto obtenido en 5.3 .

Revelar el cromatograma fuera del alcance de la luz , con ayuda de uno de

los disolventes de revelado ( 3.18 ) . La elección del disolvente debe determinarse previamente depositado en la placa 25 ml de la solución tipo cualitativa ( 3.17 ) y asegurándose de que , durante el revelado , las aflatoxinas B1 y B2 están completamente separadas .

Dejar evaporar los disolventes fuera del alcance de la luz e irradiar a continuación mediante luz ultravioleta , colocando la placa a 10 cm de la lámpara ( 4.9 ) . Las manchas de aflatoxina B1 dan una fluorescencia azul .

5.5 . Determinaciones cuantitativas

Proceder a las determinaciones bien sea visualmente , o mediante fluordensitometría según se indica en lo sucesivo :

5.5.1 . Medidas visuales

Determinar la cantidad de aflatoxina B1 del extracto comparando la intensidad de fluorescencia de las manchas del extracto con la de las manchas de la solución tipo . Interpolar si es necesario . La fluorescencia obtenida por superposición del extracto a la solución tipo debe ser más fuerte que la de los 10 ml de extracto y únicamente debe dar lugar a la percepción de una sóla mancha . Si la intensidad de fluorescencia dada por los 10 ml de extracto es más fuerte que la de los 40 ml de solución tipo , diluir el extracto 10 o 100 veces mediante cloroformo ( 3.2 ) o mediante la mezcla de benceno/acetonitrilo ( 3.6 ) antes de someterlo a una nueva cromatografía en capa fina .

5.5.2 . Medidas por fluordensitometría

Medir la intensidad de fluorescencia de las manchas de aflatoxina B1 en el fluordensitómetro ( 4.12 ) utilizando una longitud de onda de excitación de 365 nm y una longitud de onda de emisión de 443 nm . Determinar la cantidad de aflatoxina B1 de los depósitos del extracto y de la solución tipo .

5.6 . Confirmación de la identidad de aflatoxina B1

Confirmar la identidad de la aflatoxina B1 del extracto mediante los siguientes procedimientos :

5.6.1 . Tratamiento por ácido sulfúrico .

Pulverizar ácido sulfúrico ( 3.13 ) sobre el cromatograma obtenido en 5.4 . La fluorescencia de las manchas de aflatoxina B1 debe virar del azul al amarillo bajo irradiación ultravioleta .

5.6.2 . Cromatografía bidimensional que implique la formación de aflatoxina B1 - semiacetal ( aflatoxina B2a )

NB : Las operaciones descritas en lo sucesivo deben llevarse a cabo siguiendo el esquema que aparece en la figura 3 .

5.6.2.1 . Aplicación de las soluciones

Trazar en una placa ( 4.8 ) dos rectas paralelas a dos lados contiguos ( distantes 6 cm de esos lados ) , destinadas a delimitar el desplazamiento de los frentes de disolventes . Depositar en una placa , con ayuda de pipetas capilares o de microjeringas , las soluciones indicadas en lo sucesivo :

- en el punto A : un volumen de extracto purificado de la muestra obtenida en 5.3 , que contenga 2,5 nanogramos aproximadamente de aflatoxina B1 ;

- en los puntos B y C : 25 ml de la solución tipo ( 3.16 ) .

5.6.2.2 . Revelado

Revelar el cromatograma en la dirección I con ayuda del disolvente de revelado ( 3.18.1 ) [ capa de 1 cm en una cubeta no saturada ] , fuera del

alcance de la luz , hasta que el frente de disolvente alcance la línea de delimitación . Retirar la placa de la cubeta y dejar secar durante cinco minutos fuera del alcance de la luz y a la temperatura ambiente . Pulverizar a continuación ácido clorhídrico ( 3.12 ) en una banda de 2,5 cm de altura que abarque los puntos A y B ( indicada con trazos rayados en la figura 3 ) , hasta su oscurecimiento , protegiendo el resto de la placa mediante una hoja de vidrio . Dejar reaccionar durante diez minutos en la obscuridad y secar con ayuda de una corriente de aire a la temperatura ambiente .

Revelar a continuación el cromatograma en la dirección II con ayuda del disolvente de revelado ( 3.18.1 ) [ capa de 1 cm en una cubeta no saturada ] , fuera del alcance de la luz , hasta que el frente del disolvente alcance la línea de delimitación . Retirar la placa de la cubeta y dejar secar a la temperatura ambiente .

5.6.2.3 . Interpretación del cromatograma

Examinar el cromatograma con luz ultravioleta ( 4.9 ) y comprobar las observaciones indicadas en lo sucesivo :

a ) Aparición de una mancha fluorescente azul de aflatoxina B1 procedente de la solución tipo depositada en C ( desplazamiento en la dirección I ) .

b ) Aparición de una mancha fluorescente azul de aflatoxina B1 ( que no ha reaccionado con el ácido clorhídrico ) y de una mancha fluorescente azul más intensa de aflatoxina B1 - semiacetal , procedente de la solución tipo depositada en B ( desplazamiento en la dirección II ) .

c ) Aparición de manchas similares a las indicadas en la letra b ) , procedentes del extracto de la muestra depositado en A . El emplazamiento de estas manchas está definido por la distancia de desplazamiento de la aflatoxina B1 a partir del punto A en la dirección I ( la misma distancia que la recorrida por la solución tipo depositada en C ) seguida de las distancias de desplazamiento recorridas en la dirección II por la aflatoxina B1 ( que no ha reaccionado con el ácido clorhídrico ) y por la aflatoxina B1 - semiacetal ( las mismas distancias que las recorridas por la solución tipo depositada en B ) . Las intensidades de fluorescencia de las manchas de semiacetal procedentes del extracto y de la solución tipo deberían corresponderse .

6 . Cálculo de resultados

6.1 . A partir de medidas visuales

El contenido en microgramos de aflatoxina B1 por kilogramo de muestra ( ppb ) viene dado por la fórmula

S · Y · V/W · X

en la cual :

X e Y son respectivamente los volúmenes en microlitros de solución tipo de aflatoxina B1 ( 3.16 ) y del extracto , que tienen una intensidad de fluorescencia semejante ;

S = concentración en microgramos de aflatoxina B1 por ml de la solución tipo ( 3.16 ) ;

V = volumen final del extracto en microlitros , habida cuenta de las eventuales diluciones ;

W = peso en gramos de la toma de prueba correspondiente al volumen de extracto sometido a la purificación en columna .

6.2 . A partir de medidas fluordensitométricas

El contenido en microgramos de aflatoxina B1 por kilogramo de muestra ( ppb ) viene dado por la fórmula

S · V/W · Y

en la cual :

Y = volumen en microlitros del extracto depositado en la placa ( 10 ó 20 ml ) ;

S = cantidad en nanogramos de aflatoxina B1 del depósito del extracto ( habida cuenta del volumen Y ) , deducida de las determinaciones ;

V = volumen final del extracto en microlitros , habida cuenta de las eventuales diluciones ;

W = peso en gramos de la toma de prueba , correspondiente al volumen de extracto sometido a la purificación en columna .

7 . Preparación y control de la solución tipo ( 3.16 )

7.1 . Determinación de la concentración en aflatoxina B1

Preparar una solución tipo de aflatoxina B1 en el cloroformo ( 3.2 ) o en la mezcla benceno/-acetonitrilo ( 3.6 ) cuya concentración es de 8 a 10 mgrs por milílitro . Determinar el espectro de absorción entre 330 y 370 nm con ayuda de un espectrofotómetro ( 4.11 ) .

Elevar la densidad óptica ( A ) a 363 nm en el caso de la solución clorofórmica y a 348 nm en el caso de la solución en la mezcla benceno/acetonitrilo .

Calcular la concentración de microgramos de aflatoxina B1 por milílitro de solución a partir de las siguientes fórmulas :

312 · A · 1000/20600 para la solución clorofórmica ;

312 · A · 1000/19800 para la solución en la mezcla benceno/acetonitrilo .

Fuera del alcance de la luz , efectuar las diluciones convenientes para obtener una solución tipo de trabajo cuya concentración en aflatoxina B1 es de 0,1 mg aproximadamente por milílitro . Conservada en el refrigerador , dicha solución permanece estable durante dos semanas .

7.2 . Control de la pureza cromatográfica

Depositar en una placa ( 4.8 ) 5 ml de la solución tipo en 8-10 mg de aflatoxina B1 por milílitro ( ver 7.1 ) . Revelar el cromatograma según se ha indicado en 5.4 . Con la luz ultravioleta , la fluorescencia sólo debe dar lugar a la percepción de una sola mancha y no debe percibirse ninguna fluorescencia en la zona del depósito de origen .

8 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones paralelas efectuadas en la misma muestra por el mismo analista no debería superar :

- el 25 por ciento del resultado más elevado para los contenidos en aflatoxina B1 de 10 a 20 mg/kg ,

- 5 mg , en valor absoluto , para los contenidos de 20 a 50 mg/kg ,

- el 10 por ciento del resultado más elevado para los contenidos superiores a 50 mg/kg .

9 . Reproductibilidad

Ver las observaciones del punto 2 de la parte C .

B . METODO POR CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA

1 . Objeto y ámbito de aplicación

El método permite determinar el contenido en aflatoxina B1 de la alimentación animal que no entra dentro del ámbito de aplicación del método A . El límite inferior de la dosificación es de 0,01 mg/kg ( 10 ppb ) . El método no se aplica a alimentos que contengan pulpas de agrios .

2 . Principio

La muestra se somete a la extracción mediante cloroformo . Se filtra el extracto y se toma del mismo una parte alicuota que es purificada mediante cromatografía en columna de gel de sílice . El eluido evapora y el residuo se vuelve a tomar mediante un volumen determinado de cloroformo o de una mezcla de benceno y acetonitrilo . Una parte alicuota de dicha solución se somete a la cromatografía bidimensional en capa fina . La cantidad de aflatoxina B1 se determina bajo irradiación ultravioleta del cromatograma , bien sea visualmente , o a través de fluordensitometría , mediante comparación con cantidades conocidas de aflatoxina B1 extraida del alimento debe confirmarse mediante el procedimiento indicado .

3 . Reactivos

NB : Todos los reactivos deben ser de calidad « para el análisis » en la medida en que no se ha dado ninguna otra indicación .

3.1 . Acetona .

3.2 . Cloroformo , estabilizado por el del 0,5 al 1,0 por ciento de etanol de 96 ° ( v/V ) .

3.3 . n-Hexano .

3.4 . Metanol .

3.5 . Eter dietílico anhídrido , exento de peróxidos .

3.6 . Mezcla de benceno y de acetonitrilo : 98/2 ( v/v ) .

3.7 . Mezcla de cloroformo ( 3.2 ) y de metanol ( 3.4 ) : 97/3 ( v/v ) .

3.8 . Gel de sílice , para cromatografía en columna , granulometría : de 0,05 a 0,20 mm .

3.9 . Algodón hidrófilo , previamente extraído mediante el cloroformo , o lana de vidrio .

3.10 . Sulfato de sodio , anhídrido , granulado .

3.11 . Gas inerte , por ejemplo : ázoe .

3.12 . Acido clorhídrico 1 N .

3.13 . Tierra de diatomeas ( Hiflosupercel ) lavada con ácido .

3.14 . Gel de sílice G-HR o equivalente , para cromatografía en capa fina .

3.15 . Disolventes de revelado .

3.15.1 . Eter dietílico ( 3.5 ) /metanol ( 3.4 ) /agua : 94/4 , 5/1,5 ( v/v/v ) , cubeta saturada .

3.15.2 . Cloroformo ( 3.2 ) /acetona ( 3.1 ) : 9/1 ( v/v ) cubeta no saturada .

3.16 . Solución tipo de 0,1 mgr. aproximadamente de aflotoxina B1 por milímetro en el cloroformo ( 3.2 ) o en la mezcla benceno/acetonitrilo ( 3.6 ) , preparada y controlada como se indica en el punto 7 del método A .

4 . Equipo

Ver punto 4 del método A .

5 . Modo de operar

5.1 . Preparación de la muestra ver puntos 5.1 , 5.2 y 5.3 del método A .

5.2 . Extracción ver puntos 5.1 , 5.2 y 5.3 del método A .

5.3 . Purificación en columna ver puntos 5.1 , 5.2 y 5.3 del método A .

5.4 . Cromatografía bidimensional en capa fina .

5.4.1 . Aplicación de las soluciones ( seguir el esquema que aparece en la figura 1 )

Trazar en una placa ( 4.8 ) dos rectas paralelas a dos lados contiguos ( a 5 y 6 cm de distancia respectivamente de estos lados ) , destinadas a delimitar el desplazamiento de los frentes de disolventes . Depositar en la placa con ayuda de pipetas capilares o de microjeringas las soluciones indicadas en lo sucesivo :

- en el punto A , 20 ml del extracto purificado de la muestra , obtenido en 5.3 ,

- en el punto B , 20 ml de la solución tipo ( 3.16 ) ,

- en el punto C , 10 ml de la solución tipo ( 3.16 ) ,

- en el punto D , 20 ml de la solución tipo ( 3.16 ) ,

- en el punto E , 40 ml de la solución tipo ( 3.16 ) .

Secar con ayuda de una ligera corriente de aire o con gas inerte ( 3.11 ) . Las manchas obtenidas deben tener un diámetro de alrededor de 5 mm .

5.4.2 . Revelado ( seguir el esquema que aparece en la figura 1 ) .

Revelar el cromatograma en la dirección I con ayuda del disolvente de revelado ( 3.15.1 ) [ capa de 1 cm en una cubeta saturada ] , fuera del alcance de la luz , hasta que el frente del disolvente alcance la línea de delimitación . Retirar la placa de la cubeta y dejar secar , al menos durante quince minutos , fuera del alcance de la luz y a temperatura ambiente .

Revelar a continuación el cromatograma en la dirección II con ayuda del disolvente de revelado ( 3.15.2 ) [ capa de 1 cm en una cubeta no saturada ] , fuera del alcance de la luz , hasta que el frente del disolvente alcance la línea de delimitación . Retirar la placa de la cubeta y dejar secar , fuera del alcance de la luz y a temperatura ambiente .

5.4.3 . Interpretación del cromatograma ( seguir el esquema que aparece en la figura 2 )

Irradiar el cromatograma mediante luz ultravioleta colocando la placa a 10 cm de la lámpara ( 4.9 ) . Localizar el emplazamiento de las manchas de fluorescencia azul B , C , D y E de aflatoxina B1 procedentes de la solución tipo y trazar dos rectas imaginarias que pasen por estas manchas y perpendiculares a las direcciones de revelado . El punto de intersección P de estas rectas es el emplazamiento en donde debería encontrarse la mancha de aflatoxina B1 procedente del extracto de la muestra depositada en A ( figura 1 ) . No obstante , el emplazamiento en donde debería encontrarse la mancha de aflatoxina B1 procedente del extracto de la muestra depositado en A ( figura 1 ) . No obstante , el emplazamiento real de esta mancha puede encontrarse en un punto Q situado en la intersección de dos rectas imaginarias que formen entre sí un ángulo de aproximadamente 100 grados y que pase respectivamente por las manchas B y C . Determinar la cantidad de aflatoxina B1 del extracto de la muestra según se indica en 5.5 .

5.4.4 . Cromatografía complementaria

Trazar en una nueva placa ( 4.8 ) dos rectas paralelas a dos lados contiguos , según se indica en el esquema de la figura 1 , y depositar en el punto A (

ver figura 1 ) 20 ml del extracto purificado de la muestra obtenida en 5.3 y , en superposición , 20 ml de la solución tipo ( 3.16 ) . Revelar según se indica en 5.4.2 . Irradiar el cromatograma mediante luz ultravioleta ( 4.9 ) y comprobar que :

- las manchas de aflatoxina B1 del extracto y de la solución tipo se superponen ,

- la fluorescencia de esta mancha es más intensa que la de la mancha de aflatoxina B1 revelada en el punto Q de la primera placa .

- la fluorescencia de esta mancha es más intensa que la de la mancha de aflatoxina B1 revelada en el punto Q de la primera placa .

5.5 . Determinaciones cuantitativas

Proceder a las determinaciones , bien sea visualmente o mediante fluordensitometría , según se indica en lo sucesivo :

5.5.1 . Medidas visuales

Determinar la cantidad de aflatoxina B1 del extracto comparando la intensidad de fluorescencia de la mancha del extracto con la de las manchas C , D y E de la solución tipo . Interpolar si es necesario . Si la intensidad de la fluorescencia dada por los 20 ml del extracto es más fuerte que la de los 40 ml de solución tipo , diluir el extracto 10 ó 100 veces mediante cloroformo ( 3.2 ) o mediante la mezcla de benceno/acetonitrilo ( 3.6 ) antes de someterlo a una nueva cromatografía en capa fina .

5.5.2 . Medidas por fluordensitometría

Medir la intensidad de fluorescencia de las manchas de aflatoxina B1 con el fluordensitómetro ( 4.12 ) utilizando una longitud de onda de excitación de 365 nm y una longitud de emisión de 443 nm .

Determinar la cantidad de aflatoxina B1 del depósito del extracto comparando la intensidad de fluorescencia de la mancha del extracto con la de las manchas C , D y E de la solución tipo .

5.6 . Confirmación de la identidad de la aflatoxina B1

Ver punto 5.6 del método A .

6 . Cálculo de los resultados

Ver punto 6 del método A .

7 . Repetibilidad

Ver punto B del método A .

8 . Reproductibilidad

Ver las observaciones del punto 2 de la parte C .

C . OBSERVACIONES REFERENTES A LOS METODOS A Y B

1 . Desengrasado

Las muestras que contengan más del 5 por ciento de materias grasas deben desengrasarse mediante éter de petróleo ( éb. 40-60 ° C ) tras la preparación indicada en 5.1 . En dichos casos , los resultados del análisis deben atribuirse al peso de la muestra no desengrasada .

2 . Reproductibilidad de los resultados

La reproductibilidad de los resultados , es decir la variación entre los resultados obtenidos por dos o más laboratorios sobre la misma muestra , se ha calculado en :

más o menos 50 por ciento del valor medio de los resultados para los valores medios en aflatoxina B1 de 10 a 20 mg/kg ,

más o menos 10 mg/kg a partir del valor medio para los valores medios de 20 a 50 mg/kg ,

más o menos 20 por ciento del valor medio para los valores medios superiores a 50 mg/kg .

ANEXO : ver D.O.